基于網絡藥理學方法分析股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死的潛在靶點及作用機制

張雪，徐彬，劉又文，李無陰，張虹，岳辰

(1.河南省洛陽正骨醫院/河南省骨科醫院，河南 洛陽 471002；2.浙江省立同德醫院，浙江 杭州 310012)

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)屬中醫學“骨蝕”范疇[1]。中醫學理論認為，腎虛、血瘀是ONFH的基本證候，而補腎活血法則是中醫治療ONFH最主要的治則之一[2]。基于補腎活血法組方的股骨頭壞死愈膠囊是傳承兩百余年的平樂郭氏正骨治療“骨蝕”的經典方劑。前期的臨床研究顯示，股骨頭壞死愈膠囊能有效改善ONFH患者的髖關節功能，延緩病情進展[3]。相關的動物實驗也表明，該藥能夠提高激素性ONFH兔血清骨鈣素與降鈣素水平[4]。

股骨頭壞死愈膠囊的組成藥物較多，明確其治療ONFH的靶點及作用機制較為困難。網絡藥理學方法是基于系統生物學理論，根據成分、疾病、靶點之間相互作用的系統研究方法，通過高通量組學數據分析、虛擬計算及網絡數據庫檢索，對生物系統進行網絡分析，具有整體性、系統性等特點，已廣泛應用于藥物活性成分篩選、藥物作用機制及疾病發病機制研究等方面[5]。因此，本研究基于網絡藥理學方法分析了股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點及作用機制，現總結報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥物有效成分及靶點篩選分別在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)和中醫藥百科全書(encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM)數據庫中檢索股骨頭壞死愈膠囊主要組成藥物“鹿茸”“續斷”“杜仲”“丹參”“雞血藤”“黃芪”的活性成分(設定口服生物利用度≥30%、類藥性≥0.18)和靶點。剔除重復活性成分和靶點后,在UniProt數據庫中將靶點蛋白名稱轉換為規范的基因名稱，并剔除無靶點活性成分。將從TCMSP與ETCM數據庫篩選獲得的活性成分和靶點信息取并集，得到股骨頭壞死愈膠囊的有效成分和靶點信息。

1.2 關鍵靶點篩選在GeneCards數據庫中以“osteonecrosis of femoral head”為關鍵詞進行檢索，獲得ONFH相關基因。同時從GEO數據庫下載包含ONFH基因數據的GSE74089數據集，通過R軟件Limma包進行差異基因分析(篩選標準為FDR<0.05、logFC>1)得到ONFH差異表達基因。將上述ONFH相關基因、ONFH差異表達基因及1.1中獲得的藥物靶點基因輸入Venny2.1.0在線作圖網站繪制韋恩圖，將獲得的交集基因作為股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關鍵靶點。

1.3 藥物-成分-靶點蛋白互作網絡構建將1.1篩選出的有效成分和1.2篩選出的關鍵靶點基因名稱輸入到STRING數據庫(Version11.0)中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，構建藥物-成分-靶點蛋白互作網絡，將蛋白互作網絡圖導入Cytoscape3.6.1軟件進行分析，剔除孤立有效成分和孤立靶點。

1.4 關鍵靶點基因功能及信號通路富集分析使用R軟件的ClusterProfiler包對1.2篩選出的關鍵靶點基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，挖掘關鍵靶點的生物學功能和通路信息。

1.5 核心靶點篩選將1.2篩選出的關鍵靶點基因名稱輸入到STRING數據庫(Version11.0)構建關鍵靶點蛋白互作網絡，并將關鍵靶點蛋白互作網絡圖導入Cytoscape3.6.1軟件分析網絡圖中的關鍵節點及度值，篩選其中具有最高度值的靶點作為核心靶點。

2 結 果

2.1 藥物有效成分及靶點篩選結果在TCMSP中篩選到活性成分121個、靶點243個，在ETCM數據庫中篩選到活性成分95個、靶點405個。將2個數據庫中篩選到的活性成分和靶點分別取并集后獲得股骨頭壞死愈膠囊的有效成分203個(鹿茸有效成分2個、續斷有效成分6個、杜仲有效成分153個、丹參有效成分86個、雞血藤有效成分92個、黃芪有效成分134個)，靶點592個。

2.2 關鍵靶點篩選結果在GeneCards數據庫中檢索到ONFH相關基因2033個，在GEO數據庫GSE74089數據集獲得ONFH差異表達基因8178個(上調基因5061個、下調基因3117個)(圖1)。將ONFH相關基因、ONFH差異表達基因及藥物靶點基因取交集后，獲得股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的關鍵靶點57個(圖2)。

2.3 藥物-成分-靶點蛋白互作網絡構建結果構建的藥物-成分-靶點蛋白互作網路包含200個節點和500條邊，蛋白互作網絡顯示137個藥物有效成分與57個關鍵靶點有對應關系(圖3)。

2.4 關鍵靶點基因功能及信號通路富集分析結果GO功能富集分析生物學過程、細胞組分及分子功能目錄下前10位的富集分析結果見圖4，主要涉及激素反應(類固醇激素、糖皮質激素、肽激素及激素的分泌和運輸)，氧供反應(氧氣水平、缺氧和氧氣水平降低)，免疫系統過程調節(炎癥反應、白細胞遷移、T細胞活化及白細胞-細胞粘附調節)，骨細胞調節(分化、骨化、穩態、遷移)，骨小梁形成，骨重塑調節，骨化調節，軟骨發育，骨合成過程等。KEGG信號通路富集分析排名前10位的富集結果見圖5，主要包括缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)信號通路、核轉錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信號通路、鞘脂信號通路、p53信號通路、鈣信號通路、精氨酸和脯氨酸代謝信號通路。

2.5 核心靶點篩選結果以篩選出的57個關鍵靶點構建的蛋白互作網絡圖顯示，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)為具有最高度值的關鍵靶點，即核心靶點(圖6)。

3 討 論

中醫學理論認為腎藏精，主骨生髓，為先天之本。骨骼的生長發育、盛衰強弱均與腎精充盈與否有關，腎精充盈則骨有所養、骨骼強健，腎精虧虛則骨失所養、髓不實而骨不堅，因此腎精充盈是保證骨骼健康的重要條件。肝腎同源，肝藏血，腎水虧虛不能滋養肝木，又會形成血虛、血瘀，血液不能發揮其濡養作用，從而誘發骨蝕。因此，盡管歷代醫家對于骨蝕的辨證論治并不完全統一，但均認為腎虛、血瘀是其基本證候，補腎活血法為其主要治則之一。股骨頭壞死愈膠囊中，鹿茸溫腎壯陽，丹參活血化瘀，二者共為君藥；續斷、杜仲合用補肝腎、強筋骨、行血脈、助鹿茸補腎壯骨兼活血，黃芪益氣行血，雞血藤行血補血，四藥共為臣藥。諸藥合用，共奏溫補腎陽、活血祛瘀止痛之效。

圖1 GEO數據庫篩選出的股骨頭壞死差異表達基因火山圖和表達量熱圖

圖2 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關鍵靶點篩選韋恩圖

關鍵靶點基因GO功能富集分析及KEGG通路富集分析結果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的分子生物學機制主要涉及HIF-1、NF-κB、p53等信號通路，參與激素反應、氧供反應，免疫系統過程調節、骨細胞調節、骨小梁形成、骨重塑調節、骨化調節、軟骨發育、骨合成等生物學過程。已有研究表明，補腎活血藥物可通過HIF-1信號通路、NF-κB信號通路，p53信號通路治療多種疾病，包括ONFH、骨關節炎及脊柱退變[6]。HIF-1α是恢復細胞內氧濃度的關鍵調節因子，在調節干細胞血管生成中起關鍵作用[7]，也被證實參與了早期ONFH的發生發展[8]。HIF-1α信號通路被證實參與骨細胞和成骨細胞的形態和功能調節[9]。Wu等[10]發現，桃紅四物湯可以促進家兔股骨頭組織中HIF-1α及血管內皮生長因子的表達，抑制細胞凋亡，從而延緩ONFH。NF-κB是炎癥反應的主要介質，通過參與細胞因子釋放，與許多骨科疾病的發生有密切聯系[11]。Qu等[12]在ONFH患者的變性軟骨和經卵泡抑素樣蛋白1處理的軟骨細胞中檢測到NF-κB信號通路激活。Pei等[13]發現，Toll樣受體4/NF-κB的過度激活可能交互式地抑制Wnt/β-catenin信號通路并誘發ONFH，并提出NF-κB可以作為ONFH的治療靶點。Zhang等[14]研究發現，氧化應激可以提高骨髓間充質干細胞表達p53，而抑制p53表達可以顯著增強線粒體自噬，抵抗骨髓間充質干細胞的凋亡和衰老，并有效提高骨髓間充質干細胞對早期激素誘導的ONFH的修復作用。結合本研究的結果，我們認為股骨頭壞死愈膠囊的有效成分通過57個關鍵靶點，參與氧供反應、激素反應、細胞凋亡、免疫調節、骨代謝等生物學過程，進而對ONFH發揮治療作用。

圖3 構建的藥物-成分-靶點蛋白互作網絡圖

圖4 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關鍵靶點基因GO功能富集分析結果氣泡圖

圖5 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關鍵靶點基因KEGG信號通路富集分析結果氣泡圖

圖6 股骨頭壞死愈膠囊治療股骨頭壞死關鍵靶點蛋白互作網絡圖

篩選出的57個關鍵靶點的蛋白互作網絡顯示，TNF是具有最高度值的核心靶點。作為重要的炎癥因子，TNF與成骨細胞分化、成熟密切相關[15-16]，參與ONFH的發生發展[17-18]。Li等[19]的研究表明，在ONFH患者的軟骨退變過程中，TNF通過NF-κB信號通路上調了解聚蛋白樣金屬蛋白酶-7的表達，而后者可使軟骨退變加重。Peng等[20]的研究表明，移植堿性成纖維細胞生長因子-2基因轉染的間充質干細胞和異種抗原-松質骨，可以抑制TNF表達，促進ONFH的修復。Qu等[12]發現，卵泡抑素樣蛋白1在ONFH患者關節滑膜及軟骨組織中表達增加，并且可以增加ONFH模型中TNF的表達。

本研究的結果顯示，股骨頭壞死愈膠囊治療ONFH的潛在靶點為TNF，其作用機制可能為通過HIF-1、NF-κB、p53等信號通路，參與激素反應、氧供反應、免疫系統過程調節及骨形成調節等生物學過程。