高鹽暴露對(duì)高脂飲食母代敏化雄性子代血壓的影響

修天元 彭偉

高血壓作為全球罹患人數(shù)第一的心腦血管疾病，人們對(duì)其認(rèn)識(shí)已逐漸深入到基因?qū)用妗Ｔ谕瑯拥纳顥l件下，何種群體更易被誘發(fā)高血壓、其誘發(fā)機(jī)制又如何，已成為高血壓一級(jí)預(yù)防里最為重要的研究方向。1990年提出了“發(fā)育源性的成人健康和疾病”假說，之后大量的實(shí)驗(yàn)證明，母代的肥胖狀態(tài)激活了子代原本被弱化的生存基因，使后代更傾向于表現(xiàn)出節(jié)約能量、升高血壓[1]。血壓中樞敏化指由于在母體受到不良因素的影響，導(dǎo)致子代的中樞系統(tǒng)發(fā)生一系列神經(jīng)重塑，使其在成年后暴露于不良因素時(shí)更易發(fā)生高血壓[2]。本系列研究已證明高脂飲食飼養(yǎng)下的母代可上調(diào)子代中樞下丘腦內(nèi)和升壓相關(guān)核團(tuán)的敏感性，無論是正常飲食飼養(yǎng)還是繼續(xù)給予高脂飲食，子代成年后在升壓藥物的急、慢性刺激下，較正常飲食母親的正常飲食后代，均表現(xiàn)出更明顯的血壓升高狀態(tài)[3]。本實(shí)驗(yàn)將繼續(xù)探尋高脂飲食母代的雄性子代，在成年后給予不同的危險(xiǎn)因素(如高鹽飲食)暴露，對(duì)比正常飲食的后代血壓變化情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡SPF級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠，雌性20只，體重(160±10)g，雄性10只，體重(180±10) g，均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，動(dòng)物合格證書SCXK-(京)2019-0008，繁殖使用，購(gòu)進(jìn)后全部使用正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)涉及飼料均購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證書SCXK-(京)2014-0008。6周齡SD大鼠(雌性20只，雄性10只)購(gòu)入后全部正常飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，將雌鼠隨機(jī)分為2組，每組10只，合籠前分別予正常飲食和高脂飲食喂養(yǎng)2周后，雄∶雌采取1∶2循環(huán)交配法合籠，正常飲食組(C)孕前4周、孕期和哺乳期均正常飲食，高脂飲食組(H)孕前4周、孕期和哺乳期均高脂飲食。所有子代出生后，將正常飲食組母代(C)的雄性子代隨機(jī)分為正常飲食組(C/MC)和高鹽飲食組(C/MH),將高脂飲食組母代(H)的雄性子代同樣隨機(jī)分為正常飲食組(H/MC)和高鹽飲食組(H/MH)，保證4組雄性子代每組≥24只。為了消除哺乳期間每窩幼鼠數(shù)量不同導(dǎo)致母鼠喂養(yǎng)帶來的體重差異，每窩數(shù)量控制在9只左右，所有雌性子代和多余雄性子代均去除。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 主要試劑：血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)，批號(hào)：ALX-160-042-M349，購(gòu)自蘇州信達(dá)生物科技有限公司；異氟烷，批號(hào)：P8410-45，購(gòu)自德國(guó)默克；肝素鈉，批號(hào)：F20171203，購(gòu)自天津福晨化學(xué)試劑有限公司；地佐辛注射液，批號(hào)：H5330205，購(gòu)石家莊制藥有限公司；Trizol Reagent，購(gòu)自美國(guó) Invitrogen 公司；實(shí)時(shí)熒光定量所需引物，由賽默飛(中國(guó))有限公司合成；PrimeScript TM RT Master Mix，購(gòu)自日本 TaKaRa 公司；SYBR?Premix Ex Taq TM Ⅱ，購(gòu)自中國(guó) TaKaRa 公司；RNeasy? Mini Kit，購(gòu)自美國(guó) Qiagen公司。

1.2.2 主要儀器：HD-S10動(dòng)物生理信號(hào)無線遙測(cè)系統(tǒng)，購(gòu)自于美國(guó)DSI公司；Version Gold 4.0 Dataquest ART ?數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，提供于美國(guó)DSI公司； Chart version 7.2Powerlab 四通道生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，購(gòu)于美國(guó)instrumen公司；M-CENTRIFUGE 小型離心機(jī)，美國(guó) AndyBio公司；LE225D 型電子天平(1/100 000)，購(gòu)于德國(guó)賽多利斯股份公司；Mini-osmotic Pump 滲透泵，美國(guó) DURECK 公司；77019 雙目萬向支架體視顯微鏡和68001R 腦立體定位儀，均購(gòu)于深圳瑞沃德生命科技有限公司；1864干燥滅菌器，美國(guó) Cell Point Scientific公司；ABI7300 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；RT-2100C 酶標(biāo)儀，上海創(chuàng)奕科技設(shè)備有限公司；顯微手術(shù)器械(包括 Vannas 剪(500086)、Dumont鑷)，購(gòu)于美國(guó) WPI；聚氨酯管 PE10、PE50，不銹鋼套管，購(gòu)于美國(guó) Braintree 公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 功能試驗(yàn)：4組雄性后代10周齡時(shí)進(jìn)行2個(gè)相互獨(dú)立的功能試驗(yàn)，分別記錄子代在不同方式刺激下全身壓力反射應(yīng)答，檢測(cè)高脂飲食母代是否會(huì)使子代暴露在高鹽環(huán)境下更易出現(xiàn)血壓和心率變化。

1.3.1.1 植入腦室套管及急性微量注入AngⅡ的效應(yīng)：10周齡雄性子代異氟烷吸入麻醉后，使用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，將PE50導(dǎo)管前端適度拉伸后，植入股動(dòng)脈，深入長(zhǎng)度3～5 cm，插入腹主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈水平，將導(dǎo)管結(jié)扎后，腹內(nèi)至頸后皮下做隧道，將導(dǎo)管引出至頸后妥善固定，使用肝素鹽水封管。同時(shí)，使用小動(dòng)物腦室套管，于右側(cè)腦室置管，坐標(biāo)為前囟門向右1.5 mm，向后1.0 mm，向下4.5 mm深度，術(shù)后至少恢復(fù)24 h，建立清醒動(dòng)物模型。第1天從側(cè)腦室套管微量注射2 μl 0.9%氯化鈉溶液，記錄心率、血壓變化，1 h后予AngⅡ 200 ng經(jīng)微量注射器行變化側(cè)腦室注射，同樣記錄壓力反射變化，次日倒序進(jìn)行。為排除側(cè)腦室插管位置異常導(dǎo)致的統(tǒng)計(jì)誤差，所有試驗(yàn)用鼠最終給藥結(jié)束后，均經(jīng)側(cè)腦室置管注入美蘭染劑，解剖確定置管所在腦室位置正確后，再將該試驗(yàn)數(shù)據(jù)納入最終數(shù)據(jù)分析，經(jīng)后期統(tǒng)計(jì)該插管準(zhǔn)確率≥95%。

1.3.1.2 股動(dòng)脈安裝植入子和外周慢性灌注AngⅡ?qū)嶒?yàn)：8周齡雄性子代異氟烷吸入麻醉后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，通過股動(dòng)脈安裝植入子(DSI)，手術(shù)后恢復(fù)7 d，開始記錄基礎(chǔ)血壓5 d。根據(jù)大鼠體重，配制可緩釋2周的AngⅡ(130 ng·kg-1·min-1)裝入滲透泵(2002,Alzet)，植入前1 d將裝滿藥物的滲透泵浸入0.9%氯化鈉溶液中孵育過夜，以保證滲透泵工作時(shí)釋放藥物狀態(tài)穩(wěn)定。次日動(dòng)物在麻醉狀態(tài)下，于頸后兩肩胛中間前方皮膚做縱行切口將滲透泵植入，灌流AngⅡ 14 d，期間股動(dòng)脈探針24 h持續(xù)采樣，設(shè)置采樣頻率為1 000 Hz，每隔1 h采樣1次，每次從整點(diǎn)開始記錄，每次采樣5 min。

1.3.2 壓力感受器反射性檢測(cè)：急性股靜脈泵入苯腎上腺素/硝普鈉實(shí)驗(yàn)：10周齡雄性子代異氟烷吸入麻醉后，使用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，將PE50導(dǎo)管前端適度拉伸后，分別植入股動(dòng)脈和股靜脈，深入長(zhǎng)度3～5 cm，插入腹主動(dòng)脈、腎動(dòng)脈水平，將導(dǎo)管結(jié)扎后，腹內(nèi)至頸后皮下做隧道，將導(dǎo)管引出至頸后生物膠固定，使用肝素鹽水封管、定時(shí)沖管，避免堵塞。皮下注射慶大霉素抗感染和地佐辛止痛，術(shù)后動(dòng)物至少恢復(fù)24 h，建立清醒動(dòng)脈模型，待動(dòng)物能夠自由活動(dòng)后，股靜脈用于給藥，股動(dòng)脈用于連接小動(dòng)物生命信號(hào)采集系統(tǒng)記錄給藥后生命體征變化。第1天記錄5 min基礎(chǔ)生命體征后，1 mg/ml苯腎上腺素3 μl/min速度泵入5 min,2 h后給予2 mg/ml濃度硝普鈉3 μl/min 泵入，同樣記錄5 min,次日倒序進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo) (1)母代繁殖能力、子代體重增加差異；(2)子代急性側(cè)腦室給藥導(dǎo)致的全身壓力應(yīng)答反應(yīng)；(3)記錄血壓波形進(jìn)行血壓變化、心率變異等方面的分析，確定子代雄鼠對(duì)慢性灌流AngⅡ誘發(fā)高血壓的反應(yīng)性；(4)外周給予腎上腺素/硝普鈉后不同子代血壓和心率變化的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 母代繁殖能力 正常飲食組與高脂飲食組母代繁殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 母代繁殖能力 n=20

2.2 子代體重觀察 不同飲食母代的幼鼠出生體重間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),出生后1周開始高脂飲食母代的后代體重比正常飲食組增長(zhǎng)快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，該現(xiàn)象持續(xù)到離乳后第1周，后子代體重增長(zhǎng)程度無差異，直至成年前2周，高脂飲食組子代再次出現(xiàn)較快的體重增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 子代體重觀察

2.3 急性側(cè)腦室注射AngⅡ?qū)AP和HR的影響 腦室給藥后正常飲食母代比較高脂飲食母代的后代MAP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。各組MAP均有明顯上升，H/MH組側(cè)腦室注射AngⅡ后誘發(fā)的升壓效應(yīng)巨大(n=6，P<0.05)，該組比較其他3組血壓變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，但4組后代間血壓變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；對(duì)于側(cè)腦室給予AngⅡ后心率均有所下降，高脂飲食母代的后代對(duì)比正常飲食母代組后代的心率變異率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，4組后代間心率變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其中H/MH組心率變異率最大(P<0.05)。見表3、4。

表3 急性側(cè)腦室注射AngⅡ后正常飲食和高脂飲食母代的后代△MAP變化

表4 急性側(cè)腦室注射AngⅡ后△HR變化 n=20,次

2.4 慢性灌注AngⅡ?qū)ρ獕旱挠绊?10周齡時(shí)高脂飲食母代的雄性子代(n=12)基礎(chǔ)血壓為(118.57±4.75) mm Hg，基礎(chǔ)心率為(349.08±3.37)次/min，較正常飲食母代的雄性子代(n=12)的基礎(chǔ)血壓(119.93±6.29) mm Hg和基礎(chǔ)心率(349.81±3.99)次/min均有輕微升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在慢性滲透泵給藥AngⅡ后，與對(duì)照組子代比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，妊娠期、哺乳期高脂飲食母代的后代均表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的血壓升高反應(yīng)(P<0.05)，2組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。在AngⅡ開始緩慢釋放后，各組子代MAP均有上升，HR均有下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，其中H/MH組緩慢給藥AngⅡ后誘發(fā)的升壓效應(yīng)巨大(P<0.05)，心率下降幅度同樣巨大，該組比較其他3組血壓變化(P<0.01)。見表5～7。

表5 正常飲食組和高脂飲食組雄性子代10周齡基礎(chǔ)血壓/心率比較

表6 慢性灌流AngⅡ后正常飲食和高脂飲食母代的后代△MAP/△HR變化

2.5 壓力反射功能的影響 采用藥理學(xué)方法研究心臟壓力反射功能，通過苯腎上腺素或輸注硝普鈉期間血壓與心率變化相關(guān)的回歸線斜率來確定的。輸注苯腎上腺素(PE)和硝普鈉(SNP)后，無論子代是否高鹽飲食，高脂飲食母代的后代組血壓和心率的變化斜率均小于正常飲食母代組的正常飲食子代(H/MH

表7 4組雄性子代慢性灌流AngⅡ后△MAP和△HR的變化

表8 股靜脈注射PE后△MAP和△HR的相關(guān)性分析

圖1 股靜脈注射PE后△MAP和△HR的相關(guān)性

表9 股靜脈注射SNP后△MAP和△HR的相關(guān)性分析

圖2 股靜脈注射SNP后△MAP和△HR的相關(guān)性

3 討論

本研究中正常飲食母代和高脂飲食母代的子代在出生時(shí)體重并無明顯差異，但1周后高脂飲食組子代體重明顯增加，這種增勢(shì)一直延續(xù)至8周齡成年，鄭佳等[4]發(fā)現(xiàn)高脂飲食母代的后代出生體重較低，但3周后體重將明顯高于正常飲食組子代，這種現(xiàn)象被稱為“追趕型生長(zhǎng)”，是一種補(bǔ)償性生長(zhǎng)，也是后代成年后體脂更易增多、炎性因子更易釋放的基因基礎(chǔ)[5]。大量證據(jù)表明追趕型生長(zhǎng)在子代成年后顯著增加胰島素抵抗、2型糖尿病和心血管疾病的易感性[6]。由于體重受各種干擾因素較多，將其作為代謝指標(biāo)的評(píng)估過于簡(jiǎn)單，建議使用腹部脂肪含量(腹型肥胖者更有意義)和血液內(nèi)瘦素水平進(jìn)行比較。有研究證實(shí)了該論點(diǎn)，同大多數(shù)該類實(shí)驗(yàn)相同，高脂飲食母代的子代體質(zhì)量較正常飲食組母代的后代，差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但前者子代存在較典型高瘦素血癥，且隨著年齡增長(zhǎng)持續(xù)升高，同時(shí)腹部脂肪含量(大網(wǎng)膜脂肪層克數(shù))也明顯高于對(duì)照組[7-9]。

脂肪細(xì)胞可分泌多種激素和炎性因子[10]，AngⅡ是RAS的主要活性成分，脂肪組織可不受循環(huán)中RAS活動(dòng)的影響而單獨(dú)合成AngⅡ[11,12],該因子是導(dǎo)致肥胖高血壓的重要因素，研究表明孕期和/或哺乳期高脂飲食促使脂肪組織合成大量AGT，激活RAS系統(tǒng)，編程子代血壓中樞[13]，從而導(dǎo)致子代更易發(fā)生高血壓。

孕期和哺乳期高脂飲食可敏化雄性子代的高血壓相關(guān)核團(tuán)，該系列實(shí)驗(yàn)已證實(shí)8周齡子代中，高脂飲食母代組的雄性后代較正常飲食對(duì)照組腦中RAS系統(tǒng)相關(guān)受體、炎性因子活性表達(dá)均明顯增加，說明高脂飲食組子代在血壓升高之前這些基因表達(dá)已經(jīng)上調(diào)，該種效應(yīng)為成年后高血壓的發(fā)生起到易化作用[14]。前期研究也發(fā)現(xiàn)給予母代高脂飲食實(shí)現(xiàn)子代血壓中樞對(duì)AngⅡ的敏感化效應(yīng)，與其子代PVN和LT中RAS成分的mRNA表達(dá)增加有關(guān)[7]。

SFO 是 LT 的一個(gè)室周器官，缺乏血腦屏障，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中直接感知循環(huán)各種信號(hào)分子的界面，它與 PVN 間的信號(hào)聯(lián)系是 AngⅡ誘導(dǎo)的交感輸出增加型高血壓形成的重要路徑[15]。PVN 是下丘腦的一個(gè)關(guān)鍵核團(tuán)，分為大細(xì)胞區(qū)和小細(xì)胞區(qū)，小細(xì)胞區(qū)功能為接受來自SFO 關(guān)于循環(huán)肽的關(guān)鍵信息，例如循環(huán)中AngⅡ增加，SFO 神經(jīng)元的刺激會(huì)增加，隨后 PVN 神經(jīng)元發(fā)出纖維直接投射到腦干和脊髓調(diào)節(jié)交感活動(dòng)[16]。PVN 中已活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可以感知血壓升高和高能量攝入等不良刺激，并作出應(yīng)答，影響交感輸出，最終導(dǎo)致神經(jīng)源性高血壓的產(chǎn)生。而星形膠質(zhì)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活后還可導(dǎo)致PVN 中 RAS 成分的mRNA 表達(dá)增加，從而引起血壓波動(dòng)和能量代謝失衡[17]。SFO 含有大量的 ACE 和AT1R，均為中樞神經(jīng)RAS 系統(tǒng)的重要成分，SFO 神經(jīng)元激活，引起交感神經(jīng)激活，是心力衰竭和血壓升高的生理基礎(chǔ)[18]。結(jié)合前期研究，可顯示高脂飲食導(dǎo)致子代 PVN 中膠質(zhì)細(xì)胞活化，通過相應(yīng)機(jī)制易化神經(jīng)源性高血壓。

本實(shí)驗(yàn)急性側(cè)腦室給藥作用于下丘腦鹽感受器、滲透壓感受器和數(shù)個(gè)參與血壓調(diào)控的核團(tuán)，如SFO、PVN和OVLT[19]，注射1 min后，各組子代血壓均開始升高，5～10 min左右H/MC和H/MH組引起的變化幅度最大，這個(gè)結(jié)果與既往研究相符合，說明高脂飲食子代表現(xiàn)出對(duì)中樞應(yīng)激刺激的高反應(yīng)性[20]。

結(jié)合前期試驗(yàn)已證明，高脂飲食的雄性子代，在成年前，中樞神經(jīng)核團(tuán)血壓調(diào)控功能已出現(xiàn)改變，并且這些改變易化了成年暴露于高危因素下發(fā)生高血壓的傾向，因此可明確SFO成分表達(dá)是高血壓形成的基因?qū)用娴闹饕獧C(jī)制。本研究可進(jìn)一步完善原發(fā)性高血壓的發(fā)病機(jī)制，為后續(xù)治療手段提供更多的介入點(diǎn)，對(duì)于防治兩代健康均有積極意義。