circ_0013958靶向miR-622對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

張波 義艷 王永 李清燕

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腦腫瘤，其侵襲性高，易復(fù)發(fā)，預(yù)后很差；靶向治療為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療帶來(lái)了新策略[1]。深入了解膠質(zhì)瘤相關(guān)驅(qū)動(dòng)因子，尋找分子生物標(biāo)記物，對(duì)指導(dǎo)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的靶向治療具有重要意義[2]。研究表明，環(huán)狀RNA(circRNA)在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中差異表達(dá)，并調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、增殖和侵襲，circRNA可能具有可用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子靶標(biāo)[3]。研究報(bào)道circ_0013958在肺腺癌組織，細(xì)胞中均被上調(diào)，與TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)；circ_0013958促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲，并抑制了細(xì)胞凋亡；可用作潛在的非侵入性生物標(biāo)記物，用于肺腺癌的早期檢測(cè)和篩選[4]。circ_0013958在卵巢癌組織和細(xì)胞中高表達(dá)，與患者FIGO分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；敲除circ_0013958可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[5]。然而circ_0013958對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞系中miR-622的表達(dá)降低，miR-622的下調(diào)與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)高和Karnofsky評(píng)分低有關(guān)，且與預(yù)后不良有關(guān)[6]。研究報(bào)道m(xù)iR-622過(guò)表達(dá)可抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[7,8]。且研究報(bào)道circ_0101432可通過(guò)靶向miR-1258和miR-622并上調(diào)MAPK1表達(dá)來(lái)抑制肝癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，侵襲能力和肝癌腫瘤生長(zhǎng)[9]。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在研究circ_0013958是否通過(guò)調(diào)控miR-622影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年6月至2020年6月我院已確診腦膠質(zhì)瘤患者的組織標(biāo)本23例，其中男13例，女10例；年齡16～68歲，平均(35.7±1.1)歲。通過(guò)內(nèi)減壓術(shù)獲得正常腦組織標(biāo)本23例作為對(duì)照，其中男12例，女11例；年齡17～52歲，平均(34.4±2.3)歲。所有患者術(shù)前無(wú)放化療史，患者均知情且同意。

1.2 主要試劑 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251(貨號(hào)：C3027，上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(貨號(hào)：PM150110，武漢普諾賽生物公司)；Trizol試劑(貨號(hào)：15596-018)、熒光定量試劑盒(貨號(hào)：SR1110)(北京索萊寶科技有限公司)；MTT試劑盒(貨號(hào)：ZY111105，上海澤葉生物科技有限公司)；RIPA蛋白裂解液(貨號(hào)：BB-3201，上海貝博生物科技公司)；Transwell小室(貨號(hào)：3422)、Matrigel(356255)(美國(guó)Corning公司)；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：GN201-01，北京原平皓生物技術(shù)有限公司)。

1.3 細(xì)胞處理與分組 膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將si-NC、si-circ_0013958、pcDNA、pcDNA-circ_0013958、miR-NC、miR-622轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，記為si-NC組、si-circ_0013958組、pcDNA組、pcDNA-circ_0013958組、miR-NC組、miR-622組；將si-circ_0013958分別與anti-miR-NC組、anti-miR-622共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，記為si-circ_0013958+anti-miR-NC組、si-circ_0013958+anti-miR-622組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)circ_0013958和miR-622的表達(dá)水平 用Trizol試劑提取正常腦組織、膠質(zhì)瘤組織及各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行PCR，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。circ_0013958和miR-622分別以GAPDH和U6為內(nèi)參，circ_0013958上游引物序列：5’-GAACCCCCAGCTATTAGAGGTCCC-3’，下游引物序列：5’-GGAAAAGCCCAGCCAGCAAAC-3’；GAPDH上游引物序列：5’-TTCTTTTGCGTCGCCAGCCG-3’，下游引物序列：5’-GGTGACCAGGCGCCCAATAC-3’；miR-622上游引物序列：5’-ACAGTCTGCTGAGGTTGGAGC-3’，下游引物序列：5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；U6上游引物序列：5’--CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞培養(yǎng)48 h，每孔加入MTT溶液20 μl后孵育4 h，再加入DMSO溶液150 μl反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀處檢450 nm測(cè)吸光度(OD)值。

1.6 蛋白質(zhì)印跡(Western blot)法檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF上；用5%脫脂牛奶室溫封閉，然后分別加入一抗和二抗進(jìn)行孵育，曝光顯影，定影用Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算蛋白表達(dá)水平。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 (1)遷移實(shí)驗(yàn)：Transwell上室接種腫瘤細(xì)胞U251，下室加入含胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h；取出小室并吸除上室液體并擦去上室表面細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，PBS溶液沖洗2次，室溫下加入0.1%結(jié)晶紫染色30 min，沖洗2次，顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞遷移數(shù)目。(2)侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell的上室鋪上一層基質(zhì)膠，其余同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證circ_0013958和miR-622的靶向關(guān)系 使用PCR擴(kuò)增包含miR-622結(jié)合位點(diǎn)的circ_0013958序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得circ_0013958野生型載體(WT-circ_0013958)，將circ_0013958序列AGACUG突變?yōu)镃AGUCA，獲得circ_0013958突變型載體(MUT-circ_0013958)，將WT-circ_0013958、MUT-circ_0013958分別與miR-NC、miR-622共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 circ_0013958和miR-622在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 與正常腦組織比較，膠質(zhì)瘤組織中circ_0013958表達(dá)水平升高，miR-622表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 circ_0013958和miR-622在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2 干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-circ_0013958組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中circ_0013958表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，Ki-67蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖的影響

圖1 Ki-67蛋白表達(dá)

2.3 干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移侵襲的影響 與si-NC組比較，si-circ_0013958組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的遷移侵襲數(shù)減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞遷移侵襲的影響

2.4 circ_0013958靶向調(diào)控miR-622的表達(dá)(Circular RNA Interactome) Circular RNA Interactome預(yù)測(cè)顯示circ_0013958的序列中含有與miR-622互補(bǔ)的核苷酸序列)。WT-circ_0013958與miR-622共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性降低(P<0.05)，MUT-circ_0013958與miR-622共轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與pcDNA組比較，pcDNA-circ_0013958組miR-622表達(dá)水平降低；與si-NC組比較，si-circ_0013958組miR-622表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4、5。

圖3 circ_0013958的序列中含有與miR-622互補(bǔ)的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表5 circ_0013958調(diào)控miR-622的表達(dá)

2.5 miR-622過(guò)表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-622組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-622表達(dá)水平升高，細(xì)胞活性降低，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)減少，Ki-67、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖4。

2.6 抑制miR-622表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用 與si-circ_0013958+anti-miR-NC組比較，si-circ_0013958+anti-miR-622組膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中miR-622表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性升高，遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)增加，Ki-67、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平升高(P<0.05)。見(jiàn)圖5，表7。

表6 miR-622過(guò)表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

表7 抑制miR-622表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討論

具有腫瘤抑制性質(zhì)的circRNA在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起重要作用，可以用作癌癥潛在的有效治療靶標(biāo)[10]。研究表明，多種circRNA參與了膠質(zhì)瘤的進(jìn)展，如circNFIX的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后較差有關(guān)，且促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[11]。circ-0014359沉默可有效抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的活力、遷移、侵襲[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中circ_0013958表達(dá)水平升高；提示circ_0013958在膠質(zhì)瘤中可能起促癌作用。干擾circ_0013958表達(dá)后，膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中circ_0013958表達(dá)水平降低，細(xì)胞活性降低，Ki-67蛋白表達(dá)水平降低，細(xì)胞的遷移侵襲數(shù)減少，MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)水平降低；說(shuō)明干擾circ_0013958表達(dá)可抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。

miR-622是一種新型的潛在乳腺癌標(biāo)志物，可通過(guò)靶向NUAK1激酶來(lái)削弱乳腺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[13]。甲狀腺乳頭狀癌組織和細(xì)胞系中miR-622表達(dá)水平下調(diào)，miR-622表達(dá)降低與晚期臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)；miR-622過(guò)表達(dá)后可抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，并在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)[14]。miR-622的過(guò)表達(dá)抑制黑色素瘤的克隆形成，增殖和遷移[15]。以上研究說(shuō)明miR-622在多種腫瘤中均起抑癌作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織中miR-622表達(dá)水平降低，過(guò)表達(dá)miR-622可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，與前人研究結(jié)果相符[7,8]。有研究報(bào)道circ-0000211通過(guò)調(diào)節(jié)miR-622/HIF1-α促進(jìn)了肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[16]。說(shuō)明circRNA可調(diào)控miR-622的表達(dá)；本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了circ_0013958靶向調(diào)控miR-622。抑制miR-622表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾circ_0013958表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用。

綜上所述，干擾circ_0013958表達(dá)可能通過(guò)靶向上調(diào)miR-622抑制膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。