柴胡皂苷d對哮喘小鼠氣道炎癥及TLR4/NF-κB通路的影響

楊丹芬 康睿 謝圓媛 姜鵬飛

哮喘是一種以氣道慢性炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的氣促、咳嗽、胸悶和呼吸時(shí)有喘息聲，其癥狀可能隨著時(shí)間和強(qiáng)度的不同而變化[1]。氣道炎癥是導(dǎo)致哮喘臨床癥狀發(fā)生的重要原因，可存在于哮喘的所有時(shí)段，與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear transcription factor-κB，NF-κB)通路能夠激活炎性因子作用于氣道上皮細(xì)胞，引起氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性等癥狀，在哮喘的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸中起到重要作用[3,4]。柴胡皂苷d(saikosaponin-d，SSd)是從柴胡中提取純化的主要生物活性成分之一，用于治療炎癥、感染性疾病和血管疾病，或作為保肝、抗菌或抗病毒藥物[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，SSd可以顯著減輕四氯化碳引起的急性肝損傷，其機(jī)制可能是抑制肝組織中白介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和白介素-18等引起的炎癥級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)[6]。本研究通過建立哮喘小鼠模型，探討SSd對哮喘小鼠氣道炎癥及TLR4/NF-κB通路的影響，以期為臨床防治哮喘篩選新的治療藥物。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雌性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體重(18±2.0)g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：P00102008，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(黑)2018-033，自由飲水，通風(fēng)換氣8次/h，其他均依照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)。

1.2 藥品 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)美國Sigma公司，阿奇霉素(Azithromycin，AZM)(東北制藥集團(tuán)沈陽一廠生產(chǎn)，批號(hào)191008，0.25 g/支)；SSd(麥克林公司，CAS號(hào)：20874-52-6，批號(hào)：2018 MK-24)；兔抗人TLR4、NF-κB、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1β一抗(貨號(hào)ab211573、ab188183、ab215188、ab197447，英國Abcam公司)；羊抗兔IgG EnVison 二抗(貨號(hào)：7074P2，美國CST公司)；Trizol試劑(貨號(hào)15596026，美國Invitrogen公司)；熒光定量試劑盒(貨號(hào)RR036A，大連TaKaRa公司)；BCA試劑盒(貨號(hào)A53225，美國賽默飛公司)；考馬斯亮藍(lán)試劑盒(貨號(hào)B8226，美國APExBIO公司)。引物由南京金斯瑞生物公司合成提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(型號(hào)Tanon 1600，上海天能公司)；高速離心機(jī)(型號(hào)LG10-2.4A，北京醫(yī)用離心機(jī)長)；光學(xué)顯微鏡(貨號(hào)CX43，濟(jì)南歐萊博電子商務(wù)有限公司)；SDS-PAGE電泳儀、電轉(zhuǎn)化儀(貨號(hào)JY-SCZ2+、ZY5，北京君意生物科技有限公司)；超聲霧化器(型號(hào)DRS-06A，廣東多樂信電器有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物模型制作：健康雌性小鼠40只適應(yīng)性觀察喂養(yǎng)1周，隨機(jī)抽取6只作為對照組，其余小鼠用于造模，均給予普通飼料喂養(yǎng)。參考孫麗平等[7]略加改進(jìn)，首先單手固定小鼠，使其腹部向上，分別在試驗(yàn)開始的第1天和第13天給予腹腔注射0.1 ml[OVA 20 μg和Al(OH)3 1 mg]的混懸液致敏，第21天開始，將小鼠置于5 L密閉容器中，用2% OVA 0.9%氯化鈉溶液溶液10 ml進(jìn)行霧化吸入激發(fā)30 min，直到出現(xiàn)哮喘樣發(fā)作為止，連續(xù)激發(fā)10 d，試驗(yàn)中若小鼠出現(xiàn)煩躁不安、呼吸急促、腹肌抽搐、大小便失禁即為陽性反應(yīng)，表明造模成功。排除死亡或造模不成功的4只小鼠，共造模30只。

1.4.2 動(dòng)物分組、計(jì)量設(shè)置及給藥方法：驗(yàn)證成功的小鼠隨機(jī)分成5組，包括模型組(n=6)、AZM組(n=6)、低、中、高劑量SSd組(每組n=6)。AZM組按1次/d，250 mg/kg劑量，于第14天開始每天于激發(fā)前30 min腹腔注射給藥，共給藥14 d[8]。SSd低中高劑量分別為1.0、1.5、2.0 mg/kg，腹腔注射給藥，1次/d，共給藥14 d[7]。對照組和模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 6組小鼠免疫細(xì)胞的檢測：造模后每天觀察小鼠一般狀況；最后一次給藥結(jié)束2 h后，采用0.3%的戊巴比妥鈉溶液0.1～0.2 ml/10 g麻醉小鼠，剪掉小鼠頸部皮毛，剪開皮膚，分離氣管周圍組織，氣管作一橫行切口，插入氣管插管。結(jié)扎右主氣管，經(jīng)氣管插管注入10 ml 0.9%氯化鈉溶液，分3次灌注左肺，回收支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)，3 000 r/min離心10 min，棄上清液，用0.9%氯化鈉溶液重懸沉淀。Diff-Quik染色液染色BALF細(xì)胞圖片，然后分類進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4.4 HE染色觀察6組小鼠肺臟組織變化：小鼠采血后，解剖小鼠，取右側(cè)肺門組織，使用二甲苯浸泡，酒精梯度脫水，蘇木精浸泡、鹽酸酒精分化，最后氨水沖洗，并重復(fù)酒精沖洗過程，使用伊紅染色，酒精、二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ浸泡，中性樹膠封片。使用光學(xué)顯微鏡觀察小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)。

1.4.5 qRT-PCR法檢測小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平：每組6只小鼠取右側(cè)肺門部位組織約100 mg，將組織放入研磨器中，加入約2 ml PBS，離心取上清。按照Trizol法提取肺臟中總RNA，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。參照SYBR Premix Ex Taq TM 試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μl：2×SYBR Mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，模板1 μl。反應(yīng)條件為：95℃ 預(yù)變性5 min，95℃ 變性10 s、60℃ 退火30 s，72℃ 2 min，40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-ΔΔCt方法計(jì)算肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA相對表達(dá)量。見表1。

1.4.6 免疫印跡法(WB)檢測小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β 蛋白表達(dá)水平：每組6只小鼠取右側(cè)肺門部位組織約50 mg，加入6倍量冷蛋白裂解液，制成緩沖液。取一定量蛋白上樣，于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜。5%脫脂奶封閉2 h，加入TLR4、NF-κB(1∶1000)、TNF-α(1∶5 000)、IL-1β(1∶2 500)單克隆抗體，4℃孵育過夜，TBST清洗5 min×3次。加入羊抗兔IgG二抗(稀釋倍數(shù)1∶15 000)，室溫下孵育2 h，TBST清洗后ECL顯色后置于凝膠成像儀中觀察各組蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)采用Image J軟件對WB條帶進(jìn)行采集分析，并計(jì)算目的條帶與相應(yīng)內(nèi)參β-actin的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)觀察 對照組小鼠活動(dòng)正常，對外界反應(yīng)靈敏，皮毛光澤，飲食、飲水正常；模型組小鼠呼吸急促、煩躁易怒、大小便失禁、口腔周圍青紫、反應(yīng)遲鈍、毛色暗淡；AZM組小鼠飲食、飲水正常，活動(dòng)較多；SSd組小鼠較模型組癥狀減輕，活動(dòng)基本正常，飲食、飲水逐漸恢復(fù)，劑量越高狀態(tài)越好。

2.2 6組小鼠免疫細(xì)胞檢測結(jié)果比較 與對照組相比，模型組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，AZM組、低中高劑量SSd組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 6組小鼠細(xì)胞免疫檢測結(jié)果比較

2.3 小鼠肺臟組織病理學(xué)變化 對照組小鼠氣道上皮黏膜完整，纖毛排列整齊，無水腫或黏性分泌物，氣道周圍無炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡璧結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠氣道組織出現(xiàn)出血、肺泡間隙炎性細(xì)胞聚集、肺泡璧增厚及肺間質(zhì)和肺泡水腫；AZM組小鼠炎性細(xì)胞浸潤顯著減輕，肺泡結(jié)構(gòu)完整；低中高劑量SSd治療組小鼠炎性細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管充血、出血和肺泡璧增厚程度逐漸減輕。見圖1。

2.4 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β mRNA水平比較 與對照組相比，模型組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，AZM組及低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA水平均降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β mRNA水平比較

2.5 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)水平比較 與對照組相比，模型組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白水平均升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組相比，AZM組及低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白水平均降低(P<0.05)。與AZM組相比，高劑量SSd組水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖2。

表4 6組小鼠肺臟中TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)水平比較

圖2 6組小鼠肺臟組織TLR4、NF-κB、TNF-α及IL-1β蛋白表達(dá)水平

3 討論

哮喘通常被認(rèn)為好發(fā)于兒童和青少年，但實(shí)際上，>65歲人群發(fā)病率也在逐年增長，而與哮喘有關(guān)的誘因在不斷被探索，如過敏、氣道收縮/炎癥、病毒感染、空氣污染、運(yùn)動(dòng)、身體和精神壓力等[9]。現(xiàn)代研究認(rèn)為哮喘的發(fā)病主要是固有免疫與適應(yīng)性免疫相互作用的結(jié)果，兩者共同導(dǎo)致了氣道炎癥的發(fā)生。固有免疫細(xì)胞主要由巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等參與，其通過Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)等途徑，激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，主要參與微生物感染和組織損傷導(dǎo)致的急性炎性反應(yīng)，并激活適應(yīng)性免疫；同時(shí)適應(yīng)性免疫主要通過輔助性T淋巴細(xì)胞2介導(dǎo)細(xì)胞因子、趨化因子、信號(hào)通路等參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程[10]。因此探討哮喘的免疫機(jī)制可能有助于揭示哮喘的致病原因，并為臨床治療哮喘提供依據(jù)。

SSd屬環(huán)氧醚型五環(huán)三萜類齊墩果烷衍生物，多項(xiàng)研究表明，其具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗癌活性[11]。例如，SSd能通過抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，減緩阿爾茨海默病小鼠海馬小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低患病小鼠海馬組織TNF-α、IL-1β及凋亡相關(guān)蛋白水平，改善小鼠病情[12]。研究發(fā)現(xiàn)，SSd還可抑制支氣管痙攣和呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞/中性粒細(xì)胞的積聚，且呈劑量依賴性[13]。中性粒細(xì)胞具有趨化、吞噬作用和殺菌作用，與細(xì)胞的吞噬和消化功能有關(guān)，在急性和化膿性感染疾病中水平升高；巨噬細(xì)胞來源于單核細(xì)胞，參與固有免疫和特異性免疫，主要以固定細(xì)胞的形式對細(xì)胞殘片及病原體進(jìn)行吞噬和消化，并激活淋巴球或細(xì)胞免疫；淋巴細(xì)胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機(jī)體免疫應(yīng)答的重要細(xì)胞成分，具有免疫識(shí)別及產(chǎn)生特異性抗體的功能；嗜酸性粒細(xì)胞通過吞噬抗原抗體復(fù)合物，釋放多種溶酶體酶，并促進(jìn)炎性反應(yīng)，可殺滅細(xì)菌、寄生蟲。中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞在咳嗽變異型哮喘[14]、哮喘模型小鼠氣道炎癥[15]等多種哮喘疾病中水平顯著升高，參與哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程。本研究發(fā)現(xiàn)，對照組小鼠皮毛光澤、活動(dòng)正常，氣道上皮黏膜完整，周圍無炎癥細(xì)胞浸潤；模型組小鼠呼吸急促、煩躁易怒、大小便失禁、毛色暗淡，BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均升高，氣道組織出現(xiàn)出血、肺泡間隙炎性細(xì)胞聚集等癥狀。提示模型組小鼠出現(xiàn)典型哮喘癥狀，造模成功。SSd組小鼠較模型組癥狀減輕，且劑量越高狀態(tài)越好，BALF中中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞均降低，炎性細(xì)胞浸潤、毛細(xì)血管充血、出血和肺泡璧增厚程度逐漸減輕。提示SSd具有減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平，改善哮喘病情的作用。

TLRs是一個(gè)識(shí)別入侵病原體和內(nèi)源性有害刺激以誘導(dǎo)固有免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的模式識(shí)別受體亞家族[16]。在TLRs中，TLR4是主要的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)受體[17]。當(dāng)TLR4在細(xì)胞膜上表達(dá)時(shí)，它與共受體髓樣分化蛋白-2(Co-receptor myeloid differentiation protein-2，MD-2)以復(fù)合物的形式存在，LPS的刺激促使TLR-4、MD-2形成TLR4-MD-2復(fù)合物，這導(dǎo)致下游介質(zhì)的激活，包括NF-κB，其增加促炎分子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1β和IL-6、趨化因子等[16]。此外，TLR4也可通過接頭蛋白髓樣分化蛋白依賴和非依賴的方式，介導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、刺激樹突狀細(xì)胞的成熟，參與固有免疫反應(yīng)[17]。哮喘可促進(jìn)氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多、粘液分泌過度、支氣管高反應(yīng)性等，循環(huán)中高濃度IL-6的哮喘患者比沒有IL-6炎癥的患者哮喘嚴(yán)重得多，而IL-6受IL-1β的調(diào)節(jié)，因此IL-6的增加可能標(biāo)志著IL-1β活性的增加，也提示哮喘病情的加重[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，用TLR4抑制劑治療哮喘小鼠，可降低哮喘小鼠BALF中炎性細(xì)胞數(shù)量、肺纖維化水平和肺細(xì)胞凋亡[19]。另有研究顯示，通過抑制哮喘小鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB途徑，進(jìn)而降低IL-1、IL-10、TNF-α水平，可減輕哮喘誘導(dǎo)的氣道炎癥和氣道重塑[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，模型組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白水平均升高。提示模型組小鼠體內(nèi)TLR4/NF-κB通路紊亂，出現(xiàn)炎性反應(yīng)。與模型組相比，低中高劑量SSd組TLR4、NF-κB、TNF-α、IL-1β mRNA及蛋白水平均降低。上述研究表明SSd能夠降低哮喘小鼠炎癥水平可能與其抑制TLR4/NF-κB通路及其下游調(diào)控炎性因子TNF-α、IL-1β有關(guān)。

綜上所述，SSd可能具有減輕哮喘小鼠氣道炎癥水平的作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路，降低哮喘小鼠氣道炎性因子TNF-α、IL-1β水平，最終達(dá)到治療哮喘的目的。炎癥相關(guān)通路只是哮喘發(fā)生的機(jī)制之一，且上下游相關(guān)因子較多，本研究僅對TLR4/NF-κB通路及其下游因子進(jìn)行分析，可能對SSd作用機(jī)制相關(guān)通路的研究不夠全面，有待后續(xù)進(jìn)一步完善研究。