阿爾茨海默病患者外周血標(biāo)記物Aβ42、Aβ40、P-tau蛋白與Hcy的相關(guān)性研究

林劍楠 馬強(qiáng)

阿爾茨海默病目前是一種無(wú)法治愈的疾病，治療上只能延緩疾病進(jìn)展。阿爾茨海默病的病理機(jī)制是β-淀粉樣蛋白沉積在神經(jīng)元細(xì)胞外，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用，進(jìn)而神經(jīng)元內(nèi)傳遞物質(zhì)的非微管相關(guān)蛋白受損變性，聚集成神經(jīng)纖維纏結(jié)，神經(jīng)元出現(xiàn)功能障礙而漸漸凋亡。高水平Hcy是AD的危險(xiǎn)因素，能通過(guò)加快Aβ蛋白沉積以及促進(jìn)tau蛋白的過(guò)度磷酸化，在神經(jīng)元的變性過(guò)程中加快進(jìn)展。另外Hcy能引起氧化應(yīng)激、促進(jìn)炎性因子釋放，激活興奮性氨基酸受體，對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生毒性作用。腦脊液中的Aβ蛋白及tau蛋白作為診斷AD的診斷生物標(biāo)記物已列入2018年NIA-AA的AD診斷框架中，被普遍認(rèn)同[1]。但腦脊液創(chuàng)傷大，并發(fā)癥多，患者不易接受，尋找一種能代替腦脊液的生物標(biāo)記物很有必要。外周血與腦脊液之間是循環(huán)流通且處于平衡狀態(tài)，且在外周血中也能檢測(cè)到β-淀粉樣蛋白及P-tau蛋白[2],外周血中的生物標(biāo)記物研究很熱門，但結(jié)果仍存在爭(zhēng)議。本試驗(yàn)進(jìn)一步探究在阿爾茨海默病癡呆患者、輕度認(rèn)知障礙、對(duì)照組之間外周血血清中Aβ42、Aβ40、P-tau蛋白的關(guān)系以及Aβ42、Aβ40、P-tau蛋白與Hcy的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2019年9月至2020年11月住院或門診50～85歲老年患者76例，男38例，女38例；平均年齡(69.67±9.63)歲；AD組男11例，女9例；平均年齡(74.15±6.34)歲；aMCI組男12例，女11例；平均年齡(71.39±7.65)歲；對(duì)照組男15例，女18例；平均年齡(71.87±7.17)歲。經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，簽署知情同意書(shū)。AD組、aMCI組與對(duì)照組在年齡、性別比、受教育程度上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 臨床一般資料比較

1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 遺忘型輕度認(rèn)知障礙組(aMCI)組:符合2011年NIA-AA 阿爾茨海默病診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者抱怨記憶力減退或者家屬發(fā)現(xiàn)認(rèn)知領(lǐng)域減退，以情景記憶力減退明顯，可以伴隨其他認(rèn)知域損害。起病隱匿；病程常有數(shù)月或者數(shù)年；MMSE評(píng)分：文盲組為≥19分，受教育7年者≥24分)，受教育≥7年者≥26分。MoCA評(píng)分：文盲組為≥13分，受教育<7年者≥19分)，受教育≥7年者≥24分。CDR=0.5分，日常生活不受影響；Fazekas評(píng)分<3分。

1.2.2 AD組:符合2011年NIA-AA 阿爾茨海默病診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者自身或者家人發(fā)現(xiàn)多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域受損，起病隱匿，逐漸加重。MMSE評(píng)分：文盲組為≤19分，受教育<7年者≤24分)，受教育≥7年者≤26分。MoCA評(píng)分：文盲組為≤13分，受教育<7年者≤19分)，受教育≥7年者≤24分。CDR=1分,日常生活能力受影響，可伴有精神行為異常。 Fazekas評(píng)分<3分。

1.2.3 NC組:年齡、性別、受教育程度與AD組和aMCI組相匹配的健康老年人；MMSE≥28分，MoCA≥26分，CDR=0分；沒(méi)有認(rèn)知領(lǐng)域出現(xiàn)受損。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn)：排除有明確的腦血管卒中史，神經(jīng)影像遺留了相應(yīng)的責(zé)任病灶；腦白質(zhì)病變Fazekas評(píng)分≥3分；有過(guò)意識(shí)障礙；患有抑郁、焦慮或者精神疾病等可以引起假性認(rèn)知減退的疾病；既往有酒精、CO、煤氣中毒史，或者腦外傷、腦炎、癲癇、腦炎、正常顱壓腦積水等可以引起認(rèn)知障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病；患有可能導(dǎo)致輕度認(rèn)知障礙的其他系統(tǒng)疾病。

1.3 樣本采集 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下，采集肘部靜脈血2管3 ml于紅色真空非抗凝管中，一管采用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Hcy；另一管在2 h 內(nèi)進(jìn)行離心，3 000 r/min，10 min，放置于在-80℃冰箱中，等待外送檢測(cè)時(shí)取出。

1.4 檢測(cè)方法 Aβ42 、Aβ40、P-tau蛋白測(cè)定采用采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) (ELISA) 方 法，Hcy采用同位素法檢測(cè)。

1.5 觀察指標(biāo) 觀察3組的檢測(cè)結(jié)果Aβ42 、Aβ40、P-tau和Hcy是否有差異；觀察MMSE、MoCA評(píng)分與Aβ42、Aβ40、P-tau、Hcy水平是否具有相關(guān)性；觀察Aβ42、Aβ40、P-tau的診斷性能。

2 結(jié)果

2.1 3組患者M(jìn)MSE、MoCA評(píng)分比較 AD組MMSE、MoCA評(píng)分顯著低于aMCI組和NC組，aMCI組低于NC組，3組之間MMSE評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 3組患者M(jìn)MSE、MoCA評(píng)分比較 分,

2.2 3組Aβ42、Aβ40、P-tau和Hcy表達(dá)量比較 AD組Aβ42濃度低于aMCI組，aMCI組高于NC組濃度，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AD組Aβ40濃度低于aMCI組，aMCI組低于NC組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；AD組P-tau濃度高于aMCI組，aMCI組高于NC組，3組濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；AD組Hcy濃度高于aMCI組，aMCI組高于NC組，3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

2.3 MMSE、MoCA評(píng)分與Aβ42 、Aβ40、P-tau、Hcy水平的相關(guān)性 經(jīng)線性相關(guān)分析，MMSE、MoCA評(píng)分與Aβ42、P-tau蛋白水平以及Hcy水平呈負(fù)相關(guān)，P-tau、Hcy與認(rèn)知量表MoCA評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。MMSE、MoCA評(píng)分與Aβ40呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表3 3組Aβ42、Aβ40、P-tau和Hcy表達(dá)量比較

表4 MMSE、MoCA評(píng)分與Aβ42 、Aβ40、P-tau、Hcy水平相關(guān)性分析

2.4 認(rèn)知受損患者外周血Aβ42 、Aβ40、P-tau與Hcy水平的相關(guān)性 經(jīng)線性相關(guān)分析，認(rèn)知受損患者血清中Hcy表達(dá)水平與Aβ42、Aβ40呈正相關(guān)，隨著Hcy的升高，Aβ42、Aβ40的表達(dá)量呈現(xiàn)增加趨勢(shì)；血清中Hcy表達(dá)水平與P-tau蛋白呈負(fù)相關(guān)，隨著Hcy的升高，P-tau的表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。見(jiàn)表5。

表5 認(rèn)知受損患者外周血Aβ42 、Aβ40、P-tau與Hcy水平的相關(guān)性分析

2.5 Aβ42 、Aβ40、Aβ42/Aβ40、P-tau對(duì)AD的診斷性能以及聯(lián)合預(yù)測(cè)A的價(jià)值 經(jīng)簡(jiǎn)單ROC曲線分析，Aβ42 、Aβ40、Aβ42/Aβ40、P-tau的曲線下面積分別是0.509、0.326、0.644、0.700，曲線下面積最大的是P-tau為0.700，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示P-tau幫助AD的診斷價(jià)值最佳。曲線下面積最小的是Aβ40為0.326，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，Aβ40對(duì)AD的診斷價(jià)值較低。見(jiàn)表6，圖1。

表6 AD組外周血Aβ42 、Aβ40、Aβ42/Aβ、40P-tau對(duì)AD的診斷性能

圖1 Aβ42 、Aβ40、Aβ42/Aβ、P-tau的ROC曲線

2.6 對(duì)Aβ42、Aβ40與P-tau進(jìn)行Logistic回歸分析 Aβ40、Aβ42分別聯(lián)合P-tau以及三者聯(lián)合繪制ROC曲線。Aβ42聯(lián)合P-tau的曲線下面積0.791，Aβ40聯(lián)合P-tau的曲線下面積0.721，全部聯(lián)合預(yù)測(cè)的曲線下面積0.814。從ROC曲線可以看出，3個(gè)指標(biāo)全部聯(lián)合預(yù)測(cè)AD的效果最佳，曲線下面積為0.814，靈敏度55%，特異度97%。見(jiàn)圖2，表7。

圖2 Aβ42 、Aβ40、P-tau聯(lián)合預(yù)測(cè)AD的ROC曲線

3 討論

阿爾茨海默病致病原因尚未明確，主流的致病機(jī)制是β-淀粉樣的蛋白異常折疊，沉積于神經(jīng)元表面，產(chǎn)生毒性作用，維持內(nèi)外滲透壓的Na+-K+泵衰竭，進(jìn)一步線粒體出現(xiàn)功能障礙，能量供應(yīng)出現(xiàn)障礙，神經(jīng)元逐漸死亡。同時(shí)神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過(guò)度磷酸化形成纏結(jié)，神經(jīng)元出現(xiàn)功能障礙，骨架破壞，造成神經(jīng)元進(jìn)一步丟失。

表7 AD組外周血Aβ42 、Aβ40、P-tau聯(lián)合預(yù)測(cè)AD價(jià)值

淀粉樣前體蛋白(APP)裂解產(chǎn)生大量39～43個(gè)氨基酸的殘基亞型，其中Aβ42和Aβ40最常見(jiàn)，Aβ42具有疏水性，是亞型中最容易聚集沉積且毒性作用最強(qiáng)的，tau蛋白是神經(jīng)元的非微管相關(guān)蛋白，在胞體、軸突中傳遞營(yíng)養(yǎng)遞質(zhì)，維持支撐結(jié)構(gòu)作用。腦脊液中Aβ42、Aβ40、P-tau蛋白已被列入診斷AD的科研標(biāo)準(zhǔn)，正常情況下外周血與腦脊液中的Aβ42、Aβ40、P-tau蛋白可以通過(guò)血腦屏障和受體介導(dǎo)處于一個(gè)平衡流通狀態(tài)[3]。大型瑞典BioFINDER研究隊(duì)列中對(duì)腦脊液和血液中Aβ42進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)血漿Aβ42和Aβ42/40比率與腦脊液之間存在弱但顯著的相關(guān)性[4]。外周血簡(jiǎn)便易得，接受性高。關(guān)于外周血中生物標(biāo)記物的研究結(jié)果仍然有很大的爭(zhēng)議。本研究希望通過(guò)對(duì)AD外周血生物標(biāo)記物的研究能夠?yàn)樯飿?biāo)記物領(lǐng)域補(bǔ)充依據(jù)。

蛋氨酸和半胱氨酸在代謝反應(yīng)中會(huì)產(chǎn)生含硫基的氨基酸，即同型半胱氨酸。有研究表明，長(zhǎng)期高Hcy水平是AD的危險(xiǎn)因素，參與AD的病理進(jìn)展。Hcy能通過(guò)促進(jìn)Aβ的折疊，加快聚集和沉淀[5],神經(jīng)元對(duì)Aβ蛋白的敏感性漸漸增加，毒性作用增強(qiáng)[6]。同時(shí)Aβ蛋白還通過(guò)激活蛋白激酶類的生物活性，進(jìn)一步促進(jìn)tau蛋白磷酸化[7,8]。調(diào)解tau蛋白磷酸化的磷解酶，需要形成ABC異三聚體才能發(fā)揮作用，而高Hcy降低了SAM提供甲基，控制ABC異三聚體，抑制了tau蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致過(guò)度磷酸化，神經(jīng)元的內(nèi)部結(jié)構(gòu)功能出現(xiàn)障礙，引起變性死亡。Hcy除了引起Aβ、tau蛋白的改變，還有通過(guò)氧化反應(yīng)、減慢甲基化、影響基因表達(dá)[9]等途徑在AD的進(jìn)展中起重要作用[10]。Luchsinger等[11]研究通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果證明了AD患者血中的Aβ蛋白表達(dá)水平隨著Hcy濃度的逐漸升高而呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)，與AD病程程度有一定關(guān)系。本研究探討血清中Aβ42、Aβ40、P-tau在正常對(duì)照、aMCI組、AD組中的關(guān)系以及與Hcy的相關(guān)性。

AD組、aMCI組、NC組受試者的MMSE、MoCA認(rèn)知量表評(píng)分存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示對(duì)患者進(jìn)行認(rèn)知評(píng)估，能夠在一定程度上在人群中將不同認(rèn)知程度區(qū)分開(kāi)，為病情的診斷提供依據(jù)。MMSE、MoCA識(shí)別輕度認(rèn)知障礙的能力在眾多研究中已經(jīng)被證實(shí)。Tiago等[12]對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)上千篇研究薈萃分析，超過(guò)80%的文章顯示MoCA在區(qū)分輕度認(rèn)知障礙和無(wú)認(rèn)知障礙的個(gè)體方面優(yōu)于MMSE。MMSE識(shí)別aMCI的敏感性是18%，而MoCA檢測(cè)的敏感性達(dá)到90%。在輕度AD組中，MMSE的敏感性為78%，而MoCA的敏感性達(dá)到100%。MMSE和MoCA的特異性都非常好，分別為100%和87%[13]。

MMSE、MoCA量表在區(qū)分輕度認(rèn)知障礙和癡呆特異性都很好，敏感性在區(qū)分疾病程度上有所差異。對(duì)患者進(jìn)行認(rèn)知量表評(píng)估可以很好的評(píng)估患者的認(rèn)知狀態(tài)。此研究Aβ42、P-tau的表達(dá)水平與認(rèn)知評(píng)估MMSE、MoCA的評(píng)分存在負(fù)相關(guān)，提示隨著認(rèn)知的下降，外周血中Aβ42和P-tau的表達(dá)是呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。與Shekhar等[14]的研究結(jié)果中P-tau在AD、aMCI、正常老年患者之間的表達(dá)結(jié)果一致，癡呆程度的加重，Aβ42、P-tau的表達(dá)上升。Chen等[15]研究也顯示MMSE認(rèn)知評(píng)分與血漿生物標(biāo)記物Aβ42、Aβ40、P-tau水平之間均存在顯著負(fù)相關(guān)。另外有研究表明高P-tau與aMCI向AD轉(zhuǎn)化[16]和AD的快速認(rèn)知下降有關(guān)[17]。本研究Hcy水平與認(rèn)知受損的程度呈現(xiàn)正相關(guān)性，提示Hcy的高水平狀態(tài)與認(rèn)知受損有關(guān)，與很多學(xué)者研究結(jié)果[18-21]一致，這對(duì)臨床診療中早期干預(yù)控制高Hcy水平提供了有力的依據(jù)。

Tau蛋白的過(guò)度磷酸化破壞神經(jīng)元骨架，引起神經(jīng)元丟失，是AD的病理基礎(chǔ)。在本研究中，P-tau平均表達(dá)水平AD組高于aMCI組，aMCI組高于NC組，表明在P-tau水平是與認(rèn)知障礙的嚴(yán)重程度有關(guān)的。一項(xiàng)針對(duì)ADNI和BioFINDER隊(duì)列的大型研究也證實(shí)AD癡呆患者血漿P-tau濃度升高[22]。另外本研究Hcy平均表達(dá)水平AD組也高于aMCI組，aMCI組均高于NC組。與Feng等[23]研究結(jié)果證明一致，高Hcy水平與多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域的受損有關(guān),AD中Hcy表達(dá)高于正常人。除此之外，不少研究也證實(shí)了這一結(jié)果[21,23,24]。但也有一些研究認(rèn)為Hcy與認(rèn)知損傷程度無(wú)關(guān)[25]。原因可能是入組標(biāo)準(zhǔn)的不同，樣本量不同，患者基礎(chǔ)疾病有些差異導(dǎo)致。本研究中Aβ42蛋白 aMCI組高于AD組，AD組高于NC組，隨著病情進(jìn)展，Aβ42先逐漸升高，后又降低的原因可能是：(1)Aβ42毒性比Aβ40更大，且疏水性強(qiáng)，更容易聚集，級(jí)聯(lián)反應(yīng)加快沉積[26]。(2)Aβ-PET研究顯示，AD患者Aβ42/Aβ40比值降低失去平衡，會(huì)加快組織對(duì)血液中的Aβ42的吸收，導(dǎo)致外周血中Aβ42降低[27]。Hsu等[28]研究結(jié)果是AD和aMCI患者的血漿Aβ40水平顯著高于對(duì)照組，與本研究結(jié)果不同，可能由于入組受試者病情嚴(yán)重差異、樣本量差異亦或是檢驗(yàn)方法及檢測(cè)過(guò)程的影響。

高Hcy是AD的危險(xiǎn)因素，潛在聯(lián)系是淀粉樣前體蛋白(APP)代謝途徑的改變[29]。飲食誘導(dǎo)下的AD小鼠模型，高Hcy小鼠表現(xiàn)出明顯的記憶力和學(xué)習(xí)缺陷，并具有升高的Ab水平和沉積[7],并且高Hcy對(duì)tau蛋白的磷酸化作用是獨(dú)立與Aβ蛋白的。我們的研究也證明高Hcy的患者具有更高的Aβ42、Aβ40水平。經(jīng)過(guò)一系列的小鼠模型體外實(shí)驗(yàn)，免疫印跡分析表明高Hcy小鼠的tau蛋白的磷酸化是激活了CDK5途徑，Aβ的上調(diào)是改變了γ分泌酶途徑[7]。降低高Hcy水平對(duì)臨床上治療AD可能有益。

生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)AD的退行性改變過(guò)程變得越來(lái)越重要。Aβ42、Aβ40、P-tau作為AD的核心生物標(biāo)記物，已有很多研究將腦脊液中這些標(biāo)記物用來(lái)預(yù)測(cè)向AD的轉(zhuǎn)化[30,31]。在我們的研究中Aβ42、Aβ40、Aβ42/Aβ40、P-tau的曲線下面積分別是0.509、0.326、0.644、0.700。P-tau的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性最好為0.700，并且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他幾個(gè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)性能略差，原因可能與入組患者的病情程度有差別相關(guān)。單個(gè)標(biāo)記物在預(yù)測(cè)AD患者臨床結(jié)局方面具有重大挑戰(zhàn)，因?yàn)樽鳛閱蝹€(gè)預(yù)測(cè)因子，它們的功能可能較弱。我們將幾個(gè)標(biāo)記物進(jìn)行聯(lián)合，繪制了預(yù)測(cè)AD的ROC曲線。Aβ42、Aβ40聯(lián)合P-tau以及3個(gè)指標(biāo)全部聯(lián)合曲線下面積分別是0.791、0.721、0.814，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上均有意義(P<0.05)。指標(biāo)全部聯(lián)合曲線下面積最大0.814，且特異性達(dá)到97%，預(yù)測(cè)向AD轉(zhuǎn)化的能力相對(duì)較佳。Sandau等[32]也證明多個(gè)指標(biāo)聯(lián)合預(yù)測(cè)能力強(qiáng)于單個(gè)指標(biāo)的預(yù)測(cè)能力，與本研究一致。

這些血漿生物標(biāo)志物具有成本優(yōu)勢(shì)和可擴(kuò)展性優(yōu)勢(shì)，有可能實(shí)現(xiàn)更廣泛的臨床應(yīng)用和有效的人群篩查，早期發(fā)現(xiàn)AD的早期患者，給予干預(yù)措施，延緩疾病的進(jìn)展過(guò)程。本研究樣本量相對(duì)較少，若情況允許，仍需進(jìn)一步增加樣本進(jìn)行研究。