電子垃圾拆解區兒童血漿脂氧素A4水平的檢測分析

楊江夏，霍 霞，盧雪玲，羅 瓊，陳梓涵，徐錫金，3

（1．汕頭大學醫學院環境醫學與發育毒理學實驗室，廣東 汕頭 515041；2．暨南大學環境學院，廣東 廣州 510632；3．汕頭大學醫學院細胞生物學與遺傳學教研室，廣東 汕頭 515041）

脂氧素A4是通過跨細胞途徑，經不同脂氧合酶按順序催化花生四烯酸而形成的一種內源性抗炎介質[1]。脂氧素A4通過與其受體結合傳遞炎癥消退信號，即促進炎性細胞如外周血中性粒細胞的凋亡與清除，刺激單核細胞的非炎癥性趨化，增強吞噬細胞的吞噬活性，促進機體內環境穩態的恢復[2]。血漿脂氧素A4的表達水平受體內炎癥狀態的影響，其變化是多種炎癥相關疾病發展的關鍵機制[3]。本實驗室研究發現，生活在電子垃圾拆解區的兒童體內多種環境化學污染物水平均高于參照組，如重金屬[4]、多環芳烴[5]等，且化學污染物暴露刺激兒童外周血中性粒細胞、淋巴細胞等炎性細胞和IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子以及促炎介質白三烯B4水平的增加[4,6]。這些促炎介質的升高，可能激活體內抗炎通路，啟動體內多種細胞和促炎癥消退介質共同參與的抗炎程序。因此，本研究通過分析電子垃圾拆解區兒童血漿脂氧素A4水平的變化特點，探討環境化學污染物暴露對兒童免疫系統抗炎能力的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2018年11—12月，招募196名4～7歲兒童，平均年齡（5.43±0.64）歲。汕頭市貴嶼鎮（電子垃圾拆解區）兒童作為暴露組，其中男53名，女45名；汕頭市濠江區（無電子垃圾拆解活動和污染的區域）兒童作為參照組，其中男55名，女43名。所有參與兒童樣本采集前1個月內無外傷或感染性疾病。本研究經汕頭大學醫學院倫理委員會審查通過，所有參與研究的兒童家長均簽署知情同意書。

1.2 樣本采集和血漿脂氧素A4的檢測

由護士用EDTA抗凝管采集兒童空腹肘靜脈血2管，其中一管以1 500 r/min離心5 min，分離血漿，分裝后置-80℃冰箱保存；另一管運送至檢驗室使用Sysmex XE-2100全自動血液分析儀（日本Sysmex公司）分析外周血細胞計數。血漿脂氧素A4的檢測：將100 μL完全解凍的血漿分裝樣本加入甲醇混合液（200 μL甲醇混合1.5 mL超純水），用1 mol/L的鹽酸將混合液pH酸化至3.5，得到樣本處理液。用2 mL甲醇和2 mL超純水預處理Sep-Pak C18 Plus Light濾芯（美國Waters公司）；將上述樣本處理液加入濾芯，然后用5 mL超純水和5 mL正己烷先后沖洗該濾芯，用2 mL甲酸甲酯洗脫出脂氧素A4，氮氣流揮發甲酸甲酯，將殘留物溶解于1 mL稀釋過的提取物緩沖液中。采用酶聯免疫吸附試劑盒（美國Neogen公司）和Infinite M200 Pro光柵型多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）檢測提取物緩沖液中的血漿脂氧素A4。樣本前處理、檢測流程、結果測定和計算嚴格按照試劑盒的說明進行。

1.3 統計學分析

使用SPSS 24.0統計軟件進行分析。經正態性檢驗后，正態分布的計量數據采用±s，組間比較采用獨立樣本t檢驗；偏態分布的的計量數據以M（Q1，Q3）表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用GraphPad Prism 8軟件進行作圖。當P＜0.05時認為差異具有統計學意義。

2 結果

暴露組兒童血漿脂氧素A4水平[89.58（68.08，111.87）pg/mL]高于參照組兒童[80.04（61.05，97.30）pg/mL]（P＜0.05），見圖1A。年齡分層分析發現，暴露組4歲～年齡段兒童血漿脂氧素A4水平[87.76（69.30，111.77）pg/mL]高于參照組4歲～年齡段兒童[67.49（55.05，84.91）pg/mL]（P＜0.05），見圖1B。血細胞計數分析發現，暴露組兒童外周血單核細胞計數高于參照組兒童（P＜0.01），見表1。

圖1 參照組和暴露組兒童血漿脂氧素A4水平比較

表1 兩組兒童外周血炎性細胞計數比較（×109/L，±s，n=98）

表1 兩組兒童外周血炎性細胞計數比較（×109/L，±s，n=98）

1)與參照組相比，P＜0.01。

組別參照組暴露組白細胞6.84±1.82 7.10±1.53中性粒細胞3.24±1.52 3.36±1.31單核細胞0.37±0.12 0.45±0.151)

3 討論

炎癥是機體對有害刺激的免疫防御機制的一部分。炎癥的及時消退能有效防止炎癥慢性化和進一步對機體造成的損傷。研究認為，炎癥消退是一個依賴炎性滲出液中炎癥介質改變的主動和程序化進程[7]。在炎癥過程中，炎性刺激物誘導中性粒細胞快速響應，內流進入炎癥發生部位，產生前列腺素、白三烯等炎性介質，啟動并放大炎癥信號；同時，前列腺素激活中性粒細胞中15-脂氧合酶的轉錄，促進抗炎介質（如脂氧素A4）的表達，啟動抗炎信號[8-9]。脂氧素A4與脂氧素受體結合激活各種激酶，調控NF-κB等炎癥信號通路，抑制中性粒細胞的聚集和化學趨化、炎性細胞因子（IL-6、IL-8等）的表達，并通過刺激單核細胞的非炎癥性趨化和黏附、增強吞噬細胞活性等發揮抗炎作用[10]。脂氧素水平的變化可能與疾病發生發展相關。研究顯示，與健康人群相比，非重癥哮喘患者脂氧素A4水平升高；但與非重癥哮喘患者相比，重癥哮喘患者脂氧素A4及其受體的基因和蛋白表達降低，脂氧素A4的合成障礙會導致慢性炎癥和典型的氣道高反應性，引起病情進一步惡化[11]。因此，脂氧素A4水平變化與機體免疫系統抗炎能力的改變有著密切聯系。

汕頭市貴嶼鎮是一個有40多年電子垃圾處理歷史的地區。由于露天焚燒、酸洗等不規范電子垃圾拆解回收操作產生的環境污染物經空氣、廢水、塵土傳播，使該區域受到大量重金屬[12]、多環芳烴[13-14]等有害化學污染物的嚴重污染。根據本實驗室的研究，2018年招募的長期居住在貴嶼鎮的兒童體內相比于參照組有更高濃度的多環芳烴[5]、鉛[6]等環境化學污染物，且本實驗室前期研究均顯示，環境化學污染物刺激兒童外周血包括中性粒細胞、血小板、IL-6在內多種炎癥介質的升高[15]，表明這些兒童長期處于低度炎癥的狀態[16]。本研究結果顯示暴露組兒童血漿中脂氧素A4水平升高，表明電子垃圾拆解區的多種環境污染物刺激兒童免疫系統，誘發炎癥反應，同時啟動機體的抗炎保護機制，增加抗炎因子脂氧素A4的產生，促進了炎癥的消退。暴露組4歲～年齡段兒童血漿脂氧素A4比參照組高，這與低年齡組更容易受到外界有害因素的干擾、刺激炎癥與抗炎反應的發生有關，且隨著年齡的增長，兒童認知能力的提高與手口習慣的改變減少了污染物暴露的機會。此外，本實驗室的前期研究發現，暴露組兒童外周血中性粒細胞計數顯著高于參照組兒童[17]，而本研究顯示暴露組兒童外周血單核細胞計數顯著高于參照組，反映了脂氧素A4能夠減少中性粒細胞浸潤并且刺激單核細胞非炎癥性趨化而促進炎癥消退的生理作用，提示環境污染物的長時間暴露刺激兒童免疫抗炎的積極應答。

綜上所述，在電子垃圾拆解區的環境化學污染物暴露下，兒童機體內發生炎癥反應，并啟動自身抗炎機制，使機體維持內環境穩態。但長期持續的污染物暴露，使機體一直處于炎癥與抗炎的對抗狀態，超負荷消耗兒童免疫系統的抗炎介質，不利于兒童的健康生長。因此，本研究為進一步探討長期環境化學污染物暴露對體內免疫抗炎能力的影響提供了基礎。