降脂消斑片對動脈粥樣硬化小鼠血脂、IL-1β及Caspase-8的影響*

馮 君 盧豆豆，2 冉俊寧 唐聰聰 劉慧慧 劉建和△

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.寧夏醫科大學，寧夏 銀川 750004）

動脈粥樣硬化是一組常見且重要的血管疾病，系指因吸煙、高血脂、糖尿病等多種危險因素作用于血管內皮細胞后，致使內皮功能受損、通透性改變、血脂大量沉積到內膜下為主要特征的病理過程，晚期可堵塞管腔，阻滯血流，造成組織器官缺血缺氧，是心肌梗死、腦血管意外等多種危急病癥的重要危險因素［1］。有研究發現［2-4］，炎癥反應、細胞凋亡均參與動脈粥樣硬化的發生發展。本文探討中藥對高脂飲食誘導的動脈粥樣硬化小鼠血脂、白細胞介素-1β（IL-1β）及半胱氨酸蛋白水解酶-8（Caspase-8）蛋白表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性C57BL/6J小鼠20只，體質量20～25 g，4周齡，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號DWDG-202009280002。采用高脂飼料喂養（7%豬油、5%膽固醇、3%白砂糖、0.5%膽酸鈉、84.5%基礎飼料）建立動脈粥樣硬化模型。所有小鼠均飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心動物房，隨意飲食飲水，保持飼養室通風情況良好，溫度（22±0.5）℃，晝夜交替12 h光照，均受人道對待。

1.2 藥物

降脂消斑片（院內制劑，湘藥制備字Z20190067000），成分為大黃、虎杖、黃芪、當歸，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心提供，每粒0.4 g，成人用量為每次1.6 g，每日3次。阿托伐他汀鈣（輝瑞公司生產，國藥準字H20051408）。

1.3 試劑與儀器

蘇木精-伊紅染液（Wellbio）；IL-1β ELISA試劑盒（酶聯生物工程有限公司，01/2021）；Caspase-8蛋白抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司，Proteintech，66093-1-Ig）；臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，H1650R）；全自動酶標洗板機（深圳市匯松科技發展有限公司，PW-812）；多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，MB-530）；電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，DHP-500）；切片刀（萊卡，M199）；切片機（浙江金華益迪試驗器材，YD-315）；包埋機（常州中威電子儀器，BMJA）；光學顯微鏡（Motic，BA410T）等。2.5%羧甲基纖維素鈉（阿拉丁，貨號C104984）。

1.4 分組及造模

小鼠經檢疫后適應性飼養3 d，期間給予普通飼料，3 d后隨機分為正常組、模型組、西藥組、中藥組，每組5只，每鼠籠5只分開飼養。分組完成后，正常組給予普通基礎飼料飲食，其余3組均給予動脈粥樣硬化模型飼料（購自北京科澳協力飼料有限公司），喂養12周建立動脈粥樣硬化模型。

1.5 給藥方法

喂養第6周時開始藥物干預，預防性給藥6周。根據換算公式換算系數Rab=12.33，模型組給予2.5%羧甲基纖維素鈉水溶液1.5 mL/kg灌胃，西藥組給予阿托伐他汀鈣4.1 mg/kg灌胃，中藥組給予降脂消斑片984 mg/kg灌胃，每日1次。灌胃時間是每日上午給食前，每隔2～3 d記錄小鼠精神狀況、毛發光澤度、肢體活動及體質量。

1.6 標本采集與檢測

1.6.1 血脂檢測 12周后小鼠禁食12 h過夜，眼球取血，樣本在4℃冰箱放置過夜，1 500g離心10 min，吸取上層血清，放入專用試管，使用超微量動物專用多功能全自動生化分析儀檢測血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）。

1.6.2 ELISA法檢測IL-1β 處死小鼠取20 mg主動脈組織，用PBS洗去血污，剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入0.2 mL 1×PBS制成勻漿，然后置于-20℃過夜。經過反復凍融2次過夜處理破壞細胞膜后，將組織勻漿于2～8℃5 000g離心5 min取上清。取適量上清液立即進行實驗，采用ELISA方法，嚴格按照試劑盒說明書進行操作，檢測IL-1β的表達。

1.6.3 免疫組化法檢測Caspase-8蛋白 制作主動脈組織切片，0℃烤片、切片脫蠟至水；熱修復抗原：將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0），微波爐加熱至沸騰后斷電，連續煮20 min后冷卻20 min拿出，冷卻至室溫。用0.01 mol/L PBS（pH7.2～7.6）洗滌3 min，重復3次；使用1%高碘酸室溫下10 min滅活內源性酶；滴加鼠抗Caspase-8抗體（1∶100）孵育過夜，滴加二抗，DAB顯色，鏡下控制反應時間，蒸餾水洗滌終止顯色，脫水封片。應用Image j軟件對每張圖片進行分析，得出測量面積（A）與累積吸光度（IOD），IOD/A作為每一張圖片的平均光密度（AOD），AOD值越大，提示陽性表達越強。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 各組小鼠一般體征比較

在適應性喂養期間，小鼠精神、活動及皮毛均正常。造模期間，模型組、西藥組及中藥組小鼠體質量增長較正常組快，毛皮更為光亮。實驗中后期，各組小鼠均生長良好，模型組動物情緒易怒，易被驚嚇，進食量少。

2.2 各組小鼠血脂水平比較

見表1。與正常組相比，模型組TC、LDL-C水平均顯著升高，差異具有統計學意義（P＜0.01），表明動脈粥樣硬化模型建立成功；模型組、對照組及中藥組的TC、LDL-C水平較正常組升高，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，各用藥組TC、LDL-C水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；西藥組與中藥組差異無統計學意義。

表1 各組小鼠血清TC和LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

表1 各組小鼠血清TC和LDL-C水平比較（mmol/L，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

組別正常組模型組西藥組中藥組n 5 5 5 5 TC 2.23±0.16 4.56±1.01**3.67±0.70**△3.65±0.21**△LDL-C 0.47±0.11 1.88±0.68**0.89±0.15△△1.02±0.12*△△

2.3 各組小鼠炎癥因子IL-1β水平比較

見表2。與正常組相比，模型組血清中的IL-1β含量顯著高于正常組，差異有統計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥組的IL-1β含量顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.01）；西藥組與中藥組無明顯差異。

表2 各組小鼠血清中IL-1β水平及主動脈組織Caspase-8蛋白表達比較（±s）

注：與西藥組比較，☆P＜0.05。

組別正常組模型組西藥組中藥組Caspase-8 0.26±0.01 0.29±0.01**0.27±0.01△0.25±0.02△△☆n 5 5 5 5 IL-1β（ng/L）26.37±3.85 33.10±3.44**25.40±1.57△△26.21±4.45△△

2.3 各組小鼠主動脈Caspase-8凋亡蛋白表達的比較

見表2，圖1。Caspase-8陽性著色可見細胞質中均勻分布棕黃色顆粒，主要表達在小鼠的主動脈。與正常組比較，模型組Caspase-8的表達顯著增強（P＜0.01）。與模型組相比，西藥組、中藥組Caspase-8表達均下降，差異具有統計學意義（P＜0.05）；與西藥組相比，中藥組Caspase-8表達下降更明顯，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

3 討 論

目前關于動脈粥樣硬化的形成機制有很多假說，研究較多的是脂質浸潤學說。當多種病損原因致使血管內皮受損后，低密度脂蛋白逐漸沉積在管壁上，單核細胞與淋巴細胞募集到受損部位，并轉化為巨噬細胞，吞噬氧化后的低密度脂蛋白，完成清理工作的巨噬細胞變成泡沫細胞，而活化的巨噬細胞可釋放炎癥因子IL-1β和脂質等物質，吸引更多的單核細胞聚集，誘發細胞凋亡，加劇動脈粥樣硬化的進展。IL-1β屬于炎癥因子的一種，主要參與機體免疫調節，可導致炎癥的持續與放大［5］。臨床研究表明［6］，動脈粥樣硬化血清中的IL-1β較正常人明顯下降。Caspase是一類同型半胱氨酸家族的蛋白，可在特定的氨基酸序列上切割底物，其中Caspase-8是與細胞凋亡最為密切的相關蛋白之一，是細胞凋亡的關鍵調控蛋白，在細胞凋亡中占主導作用，廣泛表達于各種組織中，以血液淋巴細胞中表達最為豐富。細胞受到應激原信號刺激后，可分泌TNF-α，募集多種蛋白包括TNFR1相關死亡域（TRADD）、受體相互作用蛋白激酶 1（RIPK1）、Caspase-8等組成復合體，Caspase-8的活化進一步觸動信號通路下游的其他Caspase因子，最終發動級聯反應，通過這一過程啟動細胞凋亡的開始。故我們推測炎癥反應、細胞凋亡均與動脈粥樣硬化的形成、發展相關。

動脈粥樣硬化在中醫古籍文獻中并無相對應的名稱，根據其發病特點及臨床表現，可歸屬于中醫學的“痰飲”“瘀血”“脈痹”“血濁”等范疇。恣食肥甘膏粱厚味之品，加重脾司運化、胃主腐熟的負擔，運化失司，代謝紊亂，水飲停聚，生成痰濕、脂濁，滯留血中；而濕又最易困脾，阻礙氣機，加重脾之虛弱。《金匱要略》記載“血不利則為水”，痰液阻道，氣機不利，可致血行不暢，變生瘀血，最終形成痰瘀膠結，滲透血脈。故選用高脂飼料誘導動脈粥樣硬化小鼠模型。

降脂消斑片是本院程丑夫教授根據多年臨床經驗，結合理論指導研制而成，主要由大黃、虎杖、黃芪、當歸組成，應用于臨床多年，療效確切。前期通過臨床試驗發現［7-8］，降脂消斑片可減輕臨床癥狀，穩定斑塊，還可降低患者血清中CRP、IL-1β等炎性指標水平。動物實驗亦表明［9-11］，該藥可降低血管內皮脂質浸潤程度，下調TNF-α、PI3K等蛋白的表達，減輕粥樣斑塊的形成與進展。方中虎杖具有“壓一切熱毒”之功，為君藥；大黃降氣通腑泄濁，為臣藥；當歸補血活血，謂血中之氣藥，血中之圣藥，黃芪健脾益氣，升舉陽氣，益氣行血，氣行則血行，二者配伍，共奏行氣活血之功，共為佐使藥。全方共奏升清降濁，化痰活血之功效。虎杖苷、白藜蘆醇、大黃素、當歸揮發油等是方中的主要化學成分，實驗表明可調節血脂紊亂、抗脂質過氧化、改善血管內皮損傷而發揮抗動脈粥樣硬化的作用［12-15］。

本研究發現，與正常組相比，模型組小鼠血清中TC、LDL-C含量顯著增加，說明經高脂飲食干預后，出現了明顯的血脂異常。與模型組相比，西藥組與中藥組的TC、LDL-C水平下降，表明阿托伐他汀鈣與降脂消斑片能糾正小鼠動脈粥樣硬化病理過程中異常的血脂代謝。與正常組相比，模型組血清中的IL-1β表達含量顯著升高，提示炎癥反應參與動脈粥樣硬化的形成過程；免疫組化顯示模型組Caspase-8蛋白表達含量顯著高于正常組，提示細胞凋亡反應參與動脈粥樣硬化的發生；西藥組和中藥組Caspase-8表達顯著降低，表明阿托伐他汀鈣片與降脂消斑片可抑制動脈粥樣硬化炎癥的發生。

綜上所述，降脂消斑片通過參與調節動脈粥樣硬化小鼠的血脂水平、炎癥及凋亡反應，實現對動脈組織的保護作用。本研究闡明了降脂消斑片抗動脈粥樣硬化進展的物質基礎，其具體通路機制可在今后的實驗中進一步探討研究。