參附注射液對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障的影響及機制研究*

朱滿剛 伍 萬△ 楊 月 葉遠玲 彭偉獻

（1.浙江省杭州市中醫院，浙江 杭州 310007；2.浙江省杭州市臨平區中西醫結合醫院，浙江 杭州 311100）

膿毒癥是嚴重感染引起的宿主反應失調導致的危及生命的器官功能障礙。由于高度復雜的宿主反應，臨床表現復雜，救治困難，其發病率、死亡率仍然較高，嚴重危及患者的生命。在膿毒癥發生、發展中往往并發胃腸道損害，引起腸道菌群易位，并發多起功能衰竭，是膿毒癥死亡的重要原因之一［1-2］。本研究通過盲腸結扎穿孔術制備重度膿毒癥模型，觀察不同劑量參附注射液對血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-10（IL-10）含量、回腸組織丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性及緊密連接蛋白occludin干預效果，進一步探究參附注射液對膿毒癥大鼠腸黏膜屏障的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只8周清潔級SD大鼠，雄雌各20只，體質量（200±35）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供。動物實驗條件合格證：SYXK（浙）2018-0012，動物實驗合格證編號：2020366。

1.2 試藥與儀器 參附注射液（雅安三九藥業有限公司，國藥準字Z51020664）。試劑Bax抗體（貨號：ER1904-10）、Bcl-2抗體（貨號：ER0512）、Occludin Antibod（貨號：sc-271842，批號：A0314）（Abcam 公司提供），TNF-α（貨號：F16960）、IL-10（貨號：F15900）、MDA（貨號：F16194）、SOD（貨號：F16742）ELISA試劑盒（上海西唐生物有限公司提供），TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒（ROCHE，貨號：11684817910，南京凱基生物科技有限公司）。

1.3 分組及造模 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、參附注射液低劑量組和高劑量組，每組各10只。采用盲腸結扎穿孔術（CLP）［3-4］制備重度膿毒癥大鼠模型，腹腔注射1∶1氯胺酮和甲苯噻嗪溶液或吸入異氟醚麻醉麻醉大鼠后，剃光大鼠腹部，消毒后在無菌條件下行中線剖腹1～2 cm手術，暴露盲腸及鄰近腸道，在回盲瓣下方的底部用6.0絲線縫線緊密結扎，并在盲腸的同一側用19號針穿孔1次或2次，然后將盲腸輕輕擠壓以從穿孔部位擠出少量排泄物。盲腸返回腹腔后縫合腹膜及皮膚，皮下注射1 mL預熱的生理鹽水，使大鼠蘇醒，或放置在加熱墊上，或暴露在150℃的紅外線加熱燈下，直到蘇醒。假手術組：僅行開腹手術，不行盲腸結扎穿孔。

1.4 給藥方法 CLP術后10 min開始給藥，假手術組經和模型組經尾靜脈推注生理鹽水（10 mL/kg），參附低劑量組經尾靜脈推注參附注射液5 mL/kg+生理鹽水5 mL/kg，參附高劑量組經尾靜脈推注參附注射液10 mL/kg。

1.5 標本采集與檢測 給藥8 h后處死全部動物，收集大鼠血液標本、腸組織、腸上皮細胞進行檢測。1）炎癥評分。回腸組織用10%甲醛固定，脫水、透明、包埋、切片、HE染色后顯微鏡下觀察各組回腸組織結構并予以炎癥評分［5］。2）血清TNF-α、IL-10檢測。腹主動脈取血約2 mL，按照ELISA試劑盒說明檢測血清中TNF-α、IL-10。3）回腸組織MDA、SOD檢測。取回腸組織200 mg，剪成細小的碎片，按照ELISA試劑盒說明檢測MDA、SOD含量。4）回腸黏膜上皮細胞的凋亡檢測。應用原位細胞凋亡法（TUNEL）進行細胞凋亡檢測，鏡下隨機選取10個絨毛、隱窩，以平均每100個細胞所含凋亡細胞數計數即為凋亡指數（AI）。陽性表達：細胞核為棕黃色；陰性表達：細胞核藍色為藍色。5）緊密連接蛋白occludin檢測：將回腸組織20 mg剪切成細小的碎片，加入200 μL LRIPA裂解液，用勻漿器勻漿，經BCA法檢測蛋白濃度。取30 μg總蛋白上樣行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，脫脂封閉2 h，T-TBS緩沖液清洗膜3次，每次30 min，加入多克隆兔抗occludin抗體（一抗）（1∶500）4℃過夜，洗膜3次，再加入HRP標記的山羊抗體鼠抗（二抗）孵育2 h，蛋白電泳。用BIO-RAD凝膠系統成像，用quantity one軟件對條帶進行半定量分析。occludin蛋白含量=樣本occludin蛋白灰度值/同一樣本β-actin灰度值。6）Bax、Bcl-2檢測。取包埋的石蠟組織，采用SABC法進行免疫組化染色和DAB顯色法，分別以抗Bax（1∶200）、抗Bcl-2（1∶200）抗體為一抗，其他操作按照試劑盒說明進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量數據呈正態分布則以（±s）表示。兩組數據的比較采用t檢驗，組間比較用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般情況比較 假手術組大鼠精神佳，反應靈敏，毛發光澤，大便正常，腹腔無腥臭味，腸管無充血水腫。模型組大鼠精神萎靡，反應遲鈍，食欲差，大便稀，皮毛無光澤，腹腔可見血性腹水，腥臭味顯著，腸管顯著充血水腫，結扎的盲腸端呈暗紫色。參附組大鼠精神不佳，反應稍遲鈍，食欲欠佳，大便稀，皮毛欠光澤，腹腔可見少許腹水，無明顯腥臭味，腸管輕度充血水腫，結扎的盲腸端呈紫色。

2.2 各組大鼠血清TNF-α與IL-10比較 見表1。與假手術組比較，模型組大鼠血清TNF-α顯著增高（P＜0.05），IL-10顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，參附低、高劑量組TNF-α顯著降低（P＜0.05），IL-10顯著增高（P＜0.05）；與參附低劑量組比較，高劑量組血清TNF-α顯著降低（P＜0.05），IL-10顯著增高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-10水平及回腸組織MDA、SOD表達比較（±s）

表1 各組大鼠血清TNF-α、IL-10水平及回腸組織MDA、SOD表達比較（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05；與參附低劑量組比較，*P＜0.05。下同。

組別假手術組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 TNF-α（μg/L）13.99±2.85△89.71±14.05 44.69±4.80△29.13±4.69△*IL-10（μg/L）35.60±7.50△28.27±3.15 67.41±6.81△78.97±3.46△*MDA（pg/L）12.28±1.21△25.51±1.29 22.26±1.61△16.48±2.39△*SOD（pg/L）123.28±11.39△62.94±20.71 194.38±53.21△307.77±60.57△*

2.3 各組大鼠回腸組織MDA和SOD表達比較 見表1。與假手術組比較，模型組回腸組織MDA明顯增高（P＜0.05），SOD顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，參附低、高劑量組大鼠回腸組織MDA含量降低（P＜0.05），SOD活性增高（P＜0.05）；與參附低劑量組比較，高劑量組MDA含量明顯降低（P＜0.05），SOD活性明顯增強（P＜0.05）。

2.4 各組大鼠回腸黏膜形態學觀察比較 見圖1，見表2。假手術組大鼠回腸黏膜絨毛完整，血管周圍無腫脹及出血，肌層纖維及漿膜層正常。模型組大鼠回腸黏膜絨毛破損，明顯腫脹，可見潰瘍，血管周圍明顯出血，有較多中性粒細胞浸潤，基底層斷裂，Chiu′s評分較假手術組顯著增高（P＜0.05）。參附低劑量組、參附高劑量組大鼠回腸黏膜絨毛少量缺損，局限性壞死，少量出血，少量中性粒細胞浸潤，Chiu′s評分較模型組顯著降低（P＜0.05）。參附高劑量組較參附低劑量組大鼠回腸黏膜形態改善更明顯，Chiu′s評分進一步降低（P＜0.05）。

圖1 各組大鼠回腸黏膜形態學觀察比較（HE染色，100倍）

表2 各組大鼠回腸黏膜病理改變Chiu′s評分和上皮細胞AI比較（±s）

表2 各組大鼠回腸黏膜病理改變Chiu′s評分和上皮細胞AI比較（±s）

組別假手術組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 Chiu′s評分（分）0.30±0.03△3.80±0.42 3.30±0.48△2.50±0.52△*AI 5.39±1.45△27.21±1.55 18.20±1.29△11.68±1.45△*

2.5 各組大鼠回腸黏膜上皮細胞凋亡指數比較 見圖2，見表2。假手術組大鼠回腸黏膜上皮僅見少量凋亡細胞。模型組回腸黏膜上皮凋亡細胞明顯增加，主要累及黏膜柱狀上皮細胞和黏膜下層，其AI值顯著高于假手術組（P＜0.05）。參附低劑量組和參附高劑量組回腸黏膜上皮細胞AI值顯著低于模型組（P＜0.05）；參附高劑量組較參附低劑量組回腸黏膜上皮細胞AI值顯著降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠上皮細胞凋亡比較（TUNEL染色，400倍）

2.6 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2表達比較 見表3，圖3～圖4。與假手術組大鼠比較，模型組大鼠回腸組織促凋亡蛋白Bax顯著增高（P＜0.05），參附低、高劑量組回腸組織Bax均較模型組顯著降低（均P＜0.05），參附高劑量組較參附低劑量組降低更明顯（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組大鼠回腸組織抗凋亡蛋白Bcl-2明顯降低（P＜0.05），參附低、高劑量組回腸組織Bcl-2較模型組顯著增高（均P＜0.05）；參附高劑量組較低劑量組增高更明顯（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠回腸組織Bax表達比較（免疫組化染色，400倍）

圖4 各組大鼠回腸組織Bcl-2表達比較（免疫組化染色，400倍）

2.7 各組大鼠回腸組織緊密連接蛋白occludin表達比較 見表3，圖5。與假手術組大鼠比較，模型組回腸組織緊密連接蛋白occludin顯著降低（P＜0.05），參附低劑量組和參附高劑量組均較模型組明顯升高（P＜0.05），與參附低劑量組比較，參附高劑量組occludin蛋白表達水平明顯升高（P＜0.05）。

圖5 各組回腸組織緊密連接蛋白occludin表達電泳條帶

表3 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2光密度值和緊密連接蛋白occludin表達比較（±s）

表3 各組大鼠回腸組織Bax和Bcl-2光密度值和緊密連接蛋白occludin表達比較（±s）

組別假手術組模型組參附低劑量組參附高劑量組n 10 10 10 10 Bax 0.31±0.02△0.47±0.14 0.36±0.06△0.30±0.04△*Bcl-2 0.32±0.06△0.24±0.03 0.29±0.05△0.31±0.06△*Bax/Bcl-2 1.06±0.20△0.56±0.18 0.82±0.15△1.06±0.16△*occludin/β-actin 0.36±0.14△0.16±0.07 0.19±0.07△0.36±0.12△*

3 討 論

膿毒癥是因機體對感染的反應失調損傷了自身組織而導致的致命性器官功能障礙［6］。膿毒癥發病率和病死率高，相關流行病學顯示，全球范圍內已超過1 900萬罹患膿毒癥的患者，超過1/4的膿毒癥患者最終死亡，且發病率呈上升趨勢［7］。我國流行病學資料顯示約33.5%～48.7%膿毒癥患者因嚴重膿毒癥死亡［8］，其中膿毒癥胃腸功能障礙發病率及病死率分別為78.8%、61.7%［9］。胃腸道是嚴重膿毒癥最先、最容易受損的器官之一，是決定疾病的進展和預后的重要因素［10-11］。

有研究顯示，MDA通過裂解腸上皮細胞DNA，使得腸黏膜上皮細胞水腫、凋亡增快、緊密連接蛋白減少，從而引起腸道微生態環境損壞。所以MDA增高可以間接反映腸組織細胞損傷程度。SOD是天然的抗氧化酶，它通過阻斷脂質過氧化連鎖反應，清除體內生成的氧自由基來保護組織細胞免受損傷。本研究發現，重度膿毒癥時清除氧自由基的能力明顯下降，而脂質過氧化現象顯著，不同劑量的參附注射液均有抑制脂質過氧化，提高清除氧自由基的作用，并與劑量成正相關。

IL-10主要由單核巨噬細胞和Th2細胞分泌，能夠抑制T細胞增殖和免疫效應［12］，促進調節性T細胞、TNF-α和IL-6等炎癥因子的釋放［13-14］，可以阻斷免疫炎癥發展過程中的多個環節，具有廣泛的免疫抑制活性。TNF-α是主要由Th1細胞和活化的單核/巨噬細胞分泌的一種促炎癥介質，是炎癥早期最重要的炎癥介質，也是觸發“炎癥瀑布效應”的主要炎癥介質。有研究指出高水平的TNF-α和脂多糖可引起肺和腸上皮細胞的凋亡而導致多臟器功能障礙［15-16］。本研究發現，參附注射液能通過降低促炎介質TNF-α水平，增高抗炎介質IL-10水平，減輕或阻斷重度膿毒癥時過度激活的炎癥反應，從而減輕腸黏膜損傷程度，阻止膿毒癥病情的惡化，且作用強度與參附注射液劑量成正比。另外，大鼠CLP手術8 h后腸黏膜形態學發生顯著改變，腸上皮細胞凋亡明顯增多。其機制可能是TNF-α能通過刺激腸微血管內皮細胞和中性粒細胞表達表面黏附分子，進而破壞腸黏膜上皮細胞及加速腸黏膜上皮細胞凋亡。本研究發現重度膿毒癥時確實存在著腸上皮細胞凋亡增多的現象，而應用參附注射液對此有明顯的抑制作用，且其作用強度與參附注射液的劑量成正相關。江榮林等［17］認為參附注射液通過增加氧供應、氧輸送、組織氧含量而改善線粒體呼吸功能，增加ATP生成，從而改善腸道功能，抑制腸上皮細胞凋亡。

Bcl-2和Bax分別是經典的抗凋亡和促凋亡成員［18］。Bcl-2/Bax的比值高低是細胞凋亡的調控系統，當比值增高時抑制細胞凋亡，當比值下降時促進細胞凋亡。我們研究發現，參附注射液通過調控Bcl-2/Bax的比值來減少腸上皮細胞凋亡，且這種作用強度與參附注射液的劑量成正相關。

緊密連接是構成腸黏膜機械屏障最重要組成結構，ocludin是緊密連接蛋白主要組成蛋白，通過與相鄰細胞之間以拉鏈方式結合而封閉細胞間間隙［19-21］。在炎癥因子刺激、缺血缺氧、應激等病理情況下跨膜蛋白表達異常可導致屏障功能破壞和細胞旁通透性增加，引起腸腔內促炎分子的滲透，誘導黏膜免疫系統的激活，導致持續的炎癥和腸道組織損傷。本實驗發現，參附注射液可能通過保護跨膜蛋白的結構和功能完整，維持了腸黏膜屏障的完整性和均一性，阻止了腸道細菌和毒素的移位。

綜上所述，參附注射通過減少促炎癥介質和抗氧化的作用來減少腸黏膜上細胞的凋亡，維護腸道緊密連接蛋白來保護腸道屏障功能。