細胞凍融策略優化及設備研究進展

趙芷慧 黃永華

(上海交通大學機械與動力工程學院 上海 200240)

Arrhenius公式指出在低溫下生物樣品內的酶活性受到抑制，化學反應減慢到近乎停滯，因此理論上可實現生物材料低溫下的長期保存[1]。1949年兩位英國生物學家發現在甘油溶液中的精子能夠經歷從常溫到低溫的巨大溫度跨度而不死亡[2]，這被視為生物樣品低溫保存的首次成功嘗試。低溫凍存技術已在很多領域發揮重要作用[3-6]：在細胞治療手段中，細胞組織等生物材料長期保存及高效冷鏈供應，保證有限資源合理利用；血紅細胞、干細胞、免疫細胞等低溫保存幫助實現再生治療及異體移植；精子、卵母細胞、卵巢組織、胚胎和植物種子等低溫保存幫助實現人類輔助生殖治療以及珍稀動植物種保存等。本文闡述了細胞凍存典型方式及損傷機理，對細胞冷凍策略優化及設備研究的進展分類總結，重點梳理了在升降溫策略及載體設備層面的進展。

1 典型凍存方式及冷凍損傷

1.1 凍存方式

自然界內固體主要以晶體態和玻璃態兩種形式存在。液體轉化成固體可通過兩種方式實現[7]：一為非連續的晶態相變；二為連續的玻璃化轉變，形成高黏度的非晶體，是晶核產生與生長速度和降溫速度競爭對抗的結果，通常需要足夠快的降溫速度。上述兩種不同的途徑與形態對應兩種低溫凍存形式：程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍。

前者將生物材料放入低溫保護劑中進行預處理，然后以較慢(對于經過處理的多數哺乳動物細胞，一般為1 ℃/min)且可控的速度將樣品降溫至零下某一溫度，再移入液氮中長期保存，復溫則多采用水浴方式。目前多沿用K. Oktay等[8]提出的經典方案或優化改進，其應用相對廣泛和成熟，但操作經驗相關性強，產生低溫損傷可能性大。

后者一般使用較高濃度的低溫保護劑和超高降溫速度，使樣品凝固成無定形狀態，然后移入液氮中長期保存，復溫時也需采用相同量級甚至更快的方式。目前動物及人類的生殖細胞和干細胞已實現玻璃化冷凍[9-10]。可顯著降低冷凍損傷，但還不具有普適性。

1.2 冷凍損傷

關于生物材料從常溫到低溫的大溫區跨度產生的冷凍損傷機理有多種解釋，包括：滲透性和機械損傷，氧化性損傷(oxidative stress, OS)和低溫保護劑(cryprotectants, CPAs)毒性損傷等[1,11]。這里簡要介紹P. Mazur等[12]提出的兩因素假說，他認為有兩個獨立因素造成冷凍損傷：1)胞內冰晶損傷，冰晶生長刺穿和擠壓細胞膜，破壞細胞器，從而破壞細胞活性及正常功能；2)溶質損傷，細胞冷凍過程因為內外滲透壓差而脫水，細胞膜受壓力，細胞內電解質濃度增加，導致細胞蛋白質、溶酶體和細胞膜損傷。不同降溫速度時細胞凍存狀態如圖1所示。在慢速冷卻過程中，如果降溫速度過慢，部分細胞外液先于細胞內液結晶，細胞外液濃度增高，細胞內外的滲透壓差使細胞內水分向外滲透，過度脫水導致溶質損傷；如果降溫速度過快(但未達到玻璃化冷凍)，細胞內部的水分來不及外滲，過冷產生冰晶，造成胞內冰晶損傷。因此，慢速冷凍將會存在一個最佳降溫速率，且該速率與細胞比表面積、膜滲透性等相關，不同細胞有不同的最佳冷凍速率，但即使處于最佳冷凍速率仍無法完全避免上述兩種低溫冷凍損傷[13-14]。

圖1 不同降溫速度時細胞凍存狀態[15]

理論上，完全玻璃化冷凍時細胞內液直接進入高黏度的玻璃態，無冰晶產生，且時間極短，細胞內濃度無明顯變化，可避免低溫損傷。但水來實現完全玻璃化轉變所需要的最小降溫速率(即臨界降溫速率)為107～108℃/min[16]，幾乎無法實現。而通過加入低溫保護劑，可降低臨界降溫速度[17]。但高濃度低溫保護劑的副作用是產生細胞毒性(包括膜透化和滲透損傷)，故細胞完全玻璃化冷凍難以實現。但幸運的是，細胞可承受一定程度的小冰晶，因此沒有必要實現完全的玻璃化冷凍[18]。

玻璃化快速冷凍過程成核危險區可用圖2表示，其中Tm為熔融溫度；Th為均相成核溫度；Tg為玻璃化轉化溫度；Td為反玻璃化轉變溫度。降溫時，Tm-Tg間為冰晶快速生長危險區域，復溫時Td-Tm為冰晶再生長的重結晶危險區域。對于玻璃化快速冷凍，需要盡量減小危險區溫跨范圍并快速經過，為了避免重結晶對細胞造成的損傷，復溫速度通常要等于或高于臨界降溫速度[19]。

細胞低溫凍融的基本操作步驟可總結為：添加低溫保護劑、降溫凍存、復溫、去除低溫保護劑，最后使用。以此可提取細胞凍融3個關鍵要素：1)不同細胞本身特性，如冷適應性、體積、形狀、比表面積和膜特性等[13,21]；2)細胞外環境，如保護劑溶液的種類、濃度和添加物等[22-24]；3)升降溫策略，如升降溫速率、終止溫度、保持時間等[25-28]。

2 細胞凍存的優化策略與設備的進展

細胞凍存優化策略如表 1所示，以提高成功率為目的優化方法可從細胞、細胞外環境和升降溫策略3個層面進行分類：對細胞層面的策略包括受生物啟發的仿生結構設計、海藻糖輸送技術、冷凍前壓力預處理等；細胞外環境層面的策略包括高效低毒性低溫保護劑(CPA)合成、添加抗凍蛋白(antifreeze proteins, AFP)和抗凍糖蛋白(antifreeze glycoproteins,AFGP)、添加合成聚合物、添加抗氧化劑、添加納米顆粒、細胞封裝技術等；升降溫策略及載體設備層面的改進包括以減小體量和強化傳熱為目標的新型載體設備、微流體技術及相關冷凍設備、物理場應用等。本文主要總結升降溫策略及載體設備層面的進展，尤其針對玻璃化快速冷凍。由于材料性質(載體物性、生物材料尺寸等)及傳熱方法是升降溫速率的主要決定因素,對于升降溫策略及載體設備的改進方向主要是：減小待冷凍樣本體量以減小熱阻和強化傳熱。

表1 細胞凍存優化策略

2.1 玻璃化冷凍載體

玻璃化凍存，要求有合適的凍存載體，如表2和圖3所示。冷凍載體按形狀大致可分為細管形和環網形兩種。

表2 典型玻璃化快速冷凍載體

圖3 典型玻璃化快速冷凍載體

與Traditional straw相似，Open pulled straw(OPS)、Hemi-straw、Quartz mircro-capillarly(QMC)、Cryo-tip、Cryo-top和Kitasato vitrification system (KVS)均為細管式結構，但減少了樣本容量，其升降溫方式主要是投入液氮中降溫、水浴中復溫。OPS和Hemi-straw的管壁更薄內徑更小，但仍沿用塑料材質；QMC則采用熔融石英毛細管代替塑料獲得導熱性能的提升。Cryo-top進一步減低載樣量，在一些卵母細胞凍存實驗中展現了更好的保存效果[29]。此類細管形的玻璃化快速冷凍載體仍在不斷被改進，如2017年K. Momozawa等[9]提出一種 KVS方法，更容易控制低溫保護劑體積，載樣量為0.4 μL，并可通過體視顯微鏡觀察置樣情況，模擬計算顯示該方法獲得了更高的升降溫速率。與上述載體不同，Copper grid和Cryo-loop等則是環網狀載體的代表，通過銅網格或低溫保護劑溶液表面張力形成的薄膜加載樣品。它們的單次處理細胞數量有限，且細胞回收分離存在一定困難。需要說明的是，OPS、QMC、Cryo-top、Copper grid、Cryo-loop等載體生物樣品會直接與液氮接觸，存在污染的風險。C. J. Tiersch等[30]利用3D打印技術制作不同尺寸的圓環狀玻璃化冷凍載體，可在控制成本情況下滿足玻璃化冷凍、體積控制、標記、保護儲存樣本等功能。A. Arav等[31]使用一種以細管狀載體，投入液氮溶液中為形式的新型玻璃冷凍儀器進行卵母細胞的凍融實驗，該儀器操作簡單，自動化程度高，可標準化精確設置樣品在不同濃度保護劑溶液的暴露時間，實現了18 000 ℃/min的降溫速度和21 454 ℃/min的復溫速度。

2.2 液滴玻璃化冷凍

除了細管狀和環網狀玻璃化冷凍載體，還發展出一種以液滴形式進行玻璃化快速冷凍的方法，具體存在兩種形式，如圖4所示。

圖4 液滴形式玻璃化冷凍

1)液滴直接接觸液氮冷卻法：將載有細胞和低溫保護劑的液滴直接滴入液氮中[38-39]。V. Landa等[38]較早將小鼠胚胎以液滴形式投入液氮冷凍，液滴體積為5～20 μL，尺寸較大且穩定可控性差，升降溫速率有限。需要注意的是，方法1)因樣品與液氮直接接觸，可能對樣品產生污染，造成樣品再收集困難，且與液滴直接接觸的液氮會汽化，并在周圍形成一層蒸氣包裹液滴，從而增大傳熱熱阻降低傳熱效果，即產生Leidenfrost現象[16]。直接將液滴滴入液氮同時觀測細胞內外冰晶形成情況變得不可實現。

2)液滴接觸預冷固體表面冷卻法(solid-surface vitrification，SSV)：用液氮將導熱良好的固體金屬預冷，再將載有細胞和低溫保護劑溶液的液滴滴在該金屬表面[40]。第二種方法在一定程度上可以避免Leidenfrost現象，也使通過顯微成像系統研究成為可能。方法2)的液滴玻璃化冷凍方法取得了一些創新進展，主要體現在結合噴射、微流控、細胞打印等技術以可控且穩定的獲得體積更小的含樣液滴。R. El Assal等[41]通過微注射泵和氮氣輸送裝置組成噴射裝置，如圖5(a)所示，由聚乙烯薄膜接收含樣液滴，將噴有微滴的聚乙烯薄膜浸入無菌液氮中實現玻璃化冷凍。Shi Meng等[42]研發了一種基于超薄銀膜和細胞打印機的非接觸式液滴玻璃化冷凍裝置，如圖5(c)所示，該裝置具有兩個腔室分別提供冷/熱量的液氮/水室和盛放樣品液滴的樣品室，兩腔室中間由一層超薄銀膜隔開，含樣液滴被打印在銀膜上，通過銀膜與液氮或水接觸實現功能。如圖5(b)所示，Y. Akiyama等[43]利用壓電控制噴墨設備和兩軸自動移動臺將含有生物樣本的液滴打印到一端浸入液氮中預冷的基底上，實現無低溫保護劑的玻璃化凍存，數值顯示最高降溫速率可達37 000 ℃/min。Xia Yu等[44]改用聲學液滴噴射裝置進行3種不同細胞SSV實驗，實現了精確、高速、低保護劑濃度、稀有細胞凍存。Zhang Yu等[45]使用一種新型CryoLogic玻璃化冷凍(cryologic vitrification method, CVM)方法，該方法將樣本液滴承載在鉤狀載體上，再將接觸預冷的固體表面實現樣品液滴玻璃化冷凍，為hiPSCs安全存儲提供了新的方式。

圖5 三種液滴玻璃化冷凍裝置

2.3 微流體技術及相關冷凍設備

微流體技術是指在微觀尺度下(1 μm～1 mm)控制和操作復雜流體的技術，由于與細胞尺度相當，可對細胞進行操作與控制。微流體技術在細胞凍存領域主要有3個應用方向：細胞膜滲透特性測量與研究、低溫保護劑添加與去除，以及包括微流體封裝及微通道一體芯片等的凍存方法及設備。本文將集中介紹后兩種。

通常細胞凍存的基本流程包括低溫保護劑的添加與去除，過程中細胞在不同濃度的溶液間轉移。傳統操作中細胞內外滲透壓會發生突變，可能對細胞造成滲透性損傷。微流體技術則為細胞外環境中低溫保護劑濃度連續變化提供可能，從而減小低溫保護劑帶來的滲透性損傷。Y. S. Song等[46]研制了一個水平三入口的微流體低溫保護劑添加裝置，如圖6(a)所示，兩邊為保護劑溶液入口，中間為細胞樣品入口，實現了沿通道方向保護劑濃度的連續改變，實驗證明后細胞存活率有所提高。如圖6(b)所示，Zheng Yuan等[47]設計法微流體裝置將低溫保護劑和細胞懸液分別從兩個入口引入，先后經過流動聚焦區域、蛇形通道混合區域和平行通道平衡區域，實現連續的保護劑溶液添加，經過液氮冷凍及水浴復溫后，提高了細胞存活率。

圖6 微流體技術在細胞凍存中的部分應用

利用微流體技術可將細胞樣本處理成分散的液滴單元，作為理想的微反應器，提高傳熱傳質性能。如圖6(c)所示，Huang Haishui等[48]通過非平面流動聚焦裝置制備了含小鼠胚胎干細胞和人類脂肪干細胞的藻酸鹽水凝膠微膠囊，膠囊直徑約為220 μm，然后通過傳統塑料吸管和QMC載體實現低保護劑濃度下的玻璃化冷凍。

如果將低溫保護劑添加、降溫冷凍、升溫復蘇、低溫保護劑去除操作整合在一個微流控芯片上，可以很大程度上減小實驗操作繁瑣程度，并防止操作之間可能出現的細胞丟失以及額外的機械損傷。E. Kondo等[49]使用微流控芯片進行附著態細胞樣品的低溫凍存。Zhou Xiaoming等[50]設計出基于微通道強化傳熱原理的夾心狀微流控芯片，并以此進行細胞玻璃化保存操作。Jiang Boshi等[51]設計出一個基于疏水PDMS材質的微流控芯片，可同時實現參數控制自動化的玻璃化冷凍前處理和玻璃化冷凍操作。周新麗等[52]就不同材質的微流控一體化冷凍保存芯片進行實驗研究，在微流控芯片細胞凍存方面進行了探索。

2.4 物理場的應用

物理場包括電磁場、激光場、聲場等。物理場的引入主要從兩個途徑影響細胞凍存效果：1)提高升溫速率，使樣品內溫度場更均勻，從而抑制再結晶現象；2)影響水分子的運動狀態，進而控制降溫過程中冰晶的形成和生長[53]。

Jin Bo等[54-55]最早將激光引入低溫凍存細胞的復溫過程中，如圖7(a)所示，將印度墨水加入樣品溶液中，以Cryo-top為載體，利用液氮進行冷凍。然后使用1 064 nm紅外激光器對小鼠卵母細胞進行復溫，在低保護劑濃度及(相對)低降溫速率的情況下實現了較高的復溫存活率。K. Khosla等[17,56]針對體積更大的細胞提出細胞內外共同激光復溫的方法，如圖7(b)所示，將生物無害的金納米棒注射進入斑馬魚胚胎及低溫保護劑溶液中，通過Cryo-top和液氮進行冷凍。之后也通過1 064 nm紅外激光器進行復溫，取得較高的復溫存活率。F. Panhwar等[57]使用合成的氧化石墨烯(GO)/二硫化鉬(MoS2)納米片和808 nm近紅外激光器對液氮冷凍的人臍靜脈內皮細胞進行復溫，如圖7(c)所示，結果顯示該方法可減少冰晶形成并抑制重結晶，復溫細胞具有高存活率和完整的生物功能。Hou Yi等[58]合成 Pluronic F127-液態金屬納米顆粒(PLM NPs)和808 nm近紅外激光器對人骨髓基質細胞進行復溫，如圖7(d)所示，復溫后細胞活力約70%。Wang Jianye等[59]利用Fe3O4納米顆粒的電磁感應作用對玻璃化凍存的人臍帶基質間充質干細胞進行復溫，如圖7(e)所示，結果表明該方法可有效抑制復溫過程中的反玻璃化現，并提高凍存細胞的存活率。Cao Yuan等[60]通過3D打印制作了聚四氟乙烯載體用于大量細胞的凍存操作，并通過Fe3O4納米顆粒的電磁感應作用對凍存細胞樣品進行快速均勻復溫，如圖7(f)所示。

圖7 物理場在凍存細胞中的應用

3 總結與展望

本文在介紹程序化慢速冷凍和玻璃化快速冷凍兩種低溫凍存方式及冷凍損傷兩因素假說的基礎上，分析了細胞特性、細胞外環境和升降溫策略三個影響細胞凍存效果的要素，將細胞凍存的優化策略及設備分為細胞層面、細胞外環境層面和升降溫策略及載體設備層面三類，重點回顧與總結了細胞凍存優化在升降溫策略及載體設備層面的進展，得到如下結論：

1)完全玻璃化快速冷凍具有可以避免低溫冷凍損傷的機理優勢，是先進的凍存手段，但受限于升降溫速度和低溫保護劑毒性，現有的玻璃化冷凍方法仍不具有普適性。

2)升降溫策略及載體設備層面的優化，以減小體量、強化傳熱為宗旨，應用新型的載體設備、微流體技術和物理場達到更高的升降溫速率。其中僅依靠減小體量的方式提高升降溫速率易達到瓶頸，且對于不同體積的細胞普適性欠佳，實現組織器官層面的玻璃化凍存相當困難。因此基于微尺度強化傳熱和物理場等先進的換熱方式可能是有潛力的發展方向。此外，尋找更有效抑冰、低毒性的低溫保護劑，對樣品進行封裝、結構設計等也是有潛力的發展方向。

3)隨著高速高清成像技術和顯微技術的發展，低溫顯微成像系統可為細胞內外冰晶生長的可視化研究提供支撐，但也需要突破升降溫速率的極限，在更寬的速率范圍實現細胞降溫及復融。

本文受上海市科委創新行動計劃(20S31903400)和上海市申康促進創新能力三年行動計劃(SHDC2020CR3077B)項目資助。(The project was supported by Innovation Action Plan of Shanghai Science and Technology Commission(No.20S31903400) and Three-year Action Plan of Shanghai Shenkang to Promote Innovation Ability(No.SHDC2020CR3077B).)