蠶豆種子水分遷移路徑上的微觀結構變化

王雅博 王曉曉 李雪強 張西龍 張京京 諸 凱

(天津商業大學機械工程學院 天津市制冷技術重點實驗室 天津 300134)

生物組織是一個復雜的有機體，包含細胞內液、細胞壁、細胞膜和細胞間隙等微觀結構，其中90%的水均存在于細胞內。對于生物材料而言，水分運輸方式包括水分自由擴散和水勢梯度驅動下的水分遷移，相比于自由擴散，在水勢梯度下的水分遷移更能反映植物組織內水分輸運特性[1]。水分遷移會引起組織收縮出現質壁分離等宏觀現象，也會發生細胞破裂進而形成孔隙等微觀結構變化。如熱風干燥產品細胞組織收縮、塌陷，真空冷凍干燥產品呈現多孔結構[2]。微觀結構變化會導致宏觀變化，也會通過影響質量傳遞的擴散進而影響脫水過程，所以研究干燥過程中微觀結構的變化具有重要意義。

目前，大量研究集中于物料的水分遷移規律引起的微觀結構變化。張群等[3]分析了藍莓在干燥過程中水分遷移和內果皮微觀結構的變化，結果表明，隨著干燥過程中水分的散失，藍莓果干發生皺縮現象，微觀上為細胞壁微絲排列由緊密有序變得松散無序。盧映潔等[4]研究了帶殼鮮花生在熱風干燥過程中內部水分遷移情況以及花生仁和花生殼的微觀結構，結果表明，花生在干燥過程中內部水分逐漸向外遷移，花生內部弱結合水含量不斷減少且干燥會使花生殼與花生仁的結構變形。

由于生物組織具有一定的體積，在水勢梯度驅動下，靠近組織表面的細胞水分最容易蒸發，而組織中心的水分需由中心向外擴散至表面蒸發。因此，脫水過程中，從組織中心至表面這一水分遷移路徑中的不同位置的細胞呈現明顯差異。此外，物料的結構、成分及干燥條件也會影響脫水過程中水分遷移路徑[5]。廉苗苗等[6]對獼猴桃進行脫水實驗后發現，獼猴桃中心和邊緣部分的細胞大小差異顯著，影響了水分在中心和邊緣部分的遷移。H.C.P.Karunasena等[7]對新鮮的gala蘋果細胞組織研究發現，干燥初始階段食物材料表面水分主要從材料表面快速蒸發，內部水分傾向于向外表面擴散，并隨著熱氣流蒸發。楊興勝[8]構建了蘋果組織內水分遷移微觀模型并進行驗證，根據微觀模型分析蘋果不同微觀結構內的水分遷移規律，發現蘋果組織表面失水速率比中心快100～1 000倍。劉顯茜[9]建立了生物多孔材料干燥組織非穩態收縮遞推模型，結果表明，物料組織收縮并非由外到內同步收縮，而是先失去水分的外部先收縮，失水多的外部收縮幅度大于失水少的內部，沒有失水的部位不收縮。

目前，有關水分遷移路徑上細胞微觀結構變化規律的文獻較少。本文將蠶豆種子的微觀結構變化用尺寸參數和形狀參數進行量化，可以看出不同位置的細胞大小以及形狀變化，分析對比水分遷移路徑上不同位置下的細胞直徑、周長和面積與上表面組織邊緣細胞的直徑、周長和面積比值變化，進而得出蠶豆種子水分遷移路徑上不同位置細胞的微觀結構變化規律。對于理解潛在的細胞機制、蠶豆種子等生命材料的貯藏及后續建立干燥過程數學和物理模型提供技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為種植用蠶豆種子，購自天津。樣品在(4±0.5)℃的溫度下避光過夜。第二天進行脫水實驗。實驗前將蠶豆手工去皮，切成10 mm×10 mm×5 mm(長×寬×高)的長方體，質量為(0.41±0.01) g。

1.2 實驗過程及樣品制備

圖1所示為蠶豆樣品制備示意圖。本文實驗設備與文獻[10]真空脫水實驗設備相同。利用上述實驗設備，在97 kPa真空度下進行兩組脫水實驗，溫度分別為0 ℃和8 ℃，將上述處理的樣品脫水0、30、90、120、180、240、270 min，且每個時間點的樣品獨立制備。然后將樣品在液氮中冷凍至斷裂獲得用于顯微鏡檢查的新切面。挑選具有相對平坦切面的樣品，使用掃描電鏡(SEM，SH-5000M，日本)分別觀察研究脫水過程中的S、A、B、C、D、E處的微觀結構的變化。掃描電鏡下觀察到的切片位置為切片縱切面由上至下平均分成5份后取得每一份中間位置面積相等的方形A、B、C、D、E及由上表面中心位置取得的與A、B、C、D、E面積相等的方形S。由圖1可知，S、A、E位置處為組織邊緣，其中S位置處為上表面組織邊緣；B、C、D位置處為組織內部，其中C為樣品中心、組織中心。掃描電鏡下觀察到的切片的呈現方式為面積相等的蠶豆細胞和組織二維圖。

圖1 切片樣品制備

1.3 圖像處理分析

在本實驗中，采用1.2節的方法獲取不同溫度下各階段S、A、B、C、D、E處的SEM圖像，每個工況下可獲得約 200 張顯微圖像。使用Image-Pro Plus6.0軟件對獲得的圖像進行中值濾波、調整對比度與 γ 值、劃分子區域、二值化與邊界識別[7,10-11]，使用每個SEM圖像中可用的刻度將其轉換為實際尺寸。同樣得到直徑、周長、圓度和伸長率。對于每張給定組織樣品的SEM圖像，所有的子區域進行相同處理，得到所有數據后利用Excel進行數據處理，最后得到S、A、B、C、D、E處整體的具有代表性的平均細胞直徑、周長、面積，圓度及伸長率。每種情況下(每個時間點)，可統計150～200個細胞。

2 參數確定

為了更好地了解水分遷移路徑上不同位置細胞微觀結構的變化規律，以t時刻S位置處的細胞平均值為基準，將細胞參數標準化。這種數據處理方法可以簡化數值而且可以更加清晰地觀察A、B、C、D、E位置處細胞與S位置處細胞的相對大小變化。

(1)

式中：D為t時刻下A、B、C、D、E相對應位置的細胞平均直徑，μm；D0為t時刻下S處細胞平均直徑，μm。

(2)

式中：P為t時刻下A、B、C、D，E相對應位置的細胞平均周長，μm；P0為t時刻下S處細胞平均周長，μm。

(3)

式中：A為t時刻下A、B、C、D，E相對應位置的細胞平均面積，μm2；A0為t時刻下S處細胞平均面積，μm2。

圓度：選擇圓度(R)作為形態變化指標，表征細胞形狀的變化。R=1代表圓形，且R越小說明偏離圓的程度越大[12-13]。圓度可按式(4)計算：

(4)

式中：AP為細胞面積，μm2；Pi為細胞周長，μm。

伸長率：

(5)

3 結果與分析

SEM掃描圖像可以直觀地研究不同位置下的蠶豆細胞結構的形態，0 ℃時在電子掃描顯微鏡 200倍成像情況下得到脫水60 min不同位置的蠶豆樣品SEM圖像，如圖2所示。可知不同位置下的細胞形態大小差異顯著。在所有樣品中，S位置的細胞最小，D位置的細胞最大。C、D、E位置的細胞結構均勻，具有光滑的細胞壁且無明顯的收縮跡象。而S位置處的細胞結構不均勻，觀察到嚴重的折疊和收縮跡象。A、B位置觀察到較小的折疊和收縮跡象。這主要是由于S位置處的細胞最容易失水且最先失水，組織內部的細胞不容易失水。

圖3(a)所示為 0 ℃時不同位置的細胞相對直徑變化。由圖3(a)可知，新鮮樣品(0 min)時，不同位置細胞直徑相對變化量無規律性，說明新鮮樣品各位置上細胞直徑隨機分布。與0 min時顯著不同，隨著脫水進行細胞直徑相對變化量呈明顯的規律性。120 min之前，細胞相對直徑變化量隨樣品深度的增加先增加后減小。說明同時刻下細胞內部各處細胞直徑高于邊緣細胞，D位置處細胞具有最大直徑。這是由于：樣品邊緣(S位置)的細胞最容易向外界環境失水并產生嚴重收縮，而內部(B、C、D位置)水分要跨越細胞和細胞間隙才能流至細胞表面實現蒸發。E位置直接與反應釜底面接觸，影響了底面細胞水分的直接蒸發，導致D位置水分最不易流出。在120 min時，雖然仍呈現出中心細胞直徑遠大于邊緣細胞的情況，但D位置細胞相對變化量與C位置接近。說明90～120 min時間內C位置處的細胞比D位置處的細胞經歷了更大程度的失水及收縮。180 min的曲線相對平緩，但仍出現組織內部細胞相對直徑變化量大于邊緣細胞的情況。這種現象是由于樣品內部的溶質分子隨水分不斷向表面遷移，積累在表面形成結晶，從而造成表面硬化。產品表面硬化產生以后，水分移動的毛細管斷裂，水分移動受阻，導致邊緣細胞水分變化不大。此時，由于細胞內部也逐漸趨于脫水平衡，內部細胞直徑略大于邊緣細胞直徑。0～60 min，各個位置的相對直徑變化量不斷增加，說明內部細胞直徑和上表面組織邊緣細胞直徑差距不斷增大。60 min后，組織內部細胞直徑和上表面組織邊緣細胞直徑差距逐漸縮小。這是因為0～60 min時上表面組織邊緣大量失水，細胞收縮，上表面組織邊緣細胞直徑逐漸變小。組織內部剛開始失去自由水不發生收縮，內部細胞直徑無顯著變化。二者的相對直徑變化量增加。60 min后，上表面組織邊緣細胞已經失去大量結合水，水分含量較低，細胞直徑不再發生劇烈變化。組織內部細胞失去結合水后收縮，內部細胞直徑逐漸縮小，二者的相對直徑變化量減小。

圖3 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞相對直徑

圖3(b)所示為8 ℃時不同位置的細胞相對直徑變化。對比圖3(a)和(b)可知，不同位置處的細胞直徑變化量均呈先增加后減小的趨勢，但8 ℃時同一時刻下各個位置的相對直徑變化量小于0 ℃時的，此規律在最大相對直徑變化量上體現的更顯著。8 ℃脫水時，在C位置處呈現最大相對變化量。說明同一時刻，C位置處細胞的直徑高于其他位置細胞，是因為溫度對水分遷移有積極影響。在更高的溫度下，水分子的運動增加導致更高的水分擴散率，內部水分向外擴散[14]。此時溫度對于水分遷移的積極影響可以抵消E位置處直接接觸的消極影響。與圖3(a)不同的是圖3(b)中顯示90 min后細胞的相對直徑變化量出現上升趨勢。這是由于溫度升高，細胞發生破裂融合的比例上升，使所測量細胞直徑增加[10,15]。

圖4所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細胞相對周長變化。圖5所示為0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞相對面積變化。

圖4 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞相對周長

圖5 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞相對面積

脫水過程中相同溫度下不同位置的細胞相對直徑、相對周長、相對面積的變化趨勢一致。由圖可知，30～180 min邊緣細胞和內部細胞的尺寸差距較大，180 min時尺寸差距顯著減小。相對直徑變化與相對周長變化的范圍在-0.1～0.9之間，相對面積變化范圍在-0.2～2.4之間。表明脫水過程中不同位置下的細胞相對面積的變化要遠大于細胞相對直徑與相對周長的變化。這可能是因為細胞面積的變化更能夠體現出細胞體積的變化。因此本文專門針對絕對面積進行分析。

通過對比分析圖3～圖5可知，溫度對不同位置的細胞尺寸參數的變化有影響。這是因為較高的溫度可以增加空氣和樣品之間的熱傳遞，并加速水的遷移[16]。0～30 min，溫度越高，各個位置的尺寸參數變化越大。這種現象是因為溫度能降低水分所受到的束縛力[17]，導致水分逐漸散失且內部水分逐漸向外遷移，促進細胞的收縮變形。相同溫度下的細胞相對直徑最大變化量、細胞相對周長最大變化量以及細胞相對面積最大變化量均在同一位置取得。0 ℃時最大相對變化量呈現在D位置處。8 ℃時最大相對變化量呈現在C位置處。

圖6(a)所示為0 ℃時不同位置下的細胞面積。30～120 min時，同一時刻下隨著樣品位置距離的增加，細胞面積由S位置處的4 000～7 500 μm2升至D位置處的13 000～16 000 μm2然后降至E位置處的10 000～11 000 μm2。即細胞面積隨厚度增加先增加后減小，在D位置處取得最大值。說明相同溫度相同時刻下不同位置的細胞面積不同，組織邊緣細胞的面積小于組織內部的，上組織邊緣的細胞面積最小。因為組織邊緣細胞先于組織中心細胞失水且發生收縮，收縮使得細胞壁發生折疊，細胞面積減小。E位置直接和反應釜底面接觸減小了其表面擴散系數，導致底面細胞水分的蒸發減少致使D位置水分最不易流出，發生收縮程度小，面積比其他位置大。180 min時不同位置下的細胞面積集中在5 000～7 500 μm2之間，差異較小，說明完全脫水后，不同位置的細胞面積并未產生顯著差異。這主要是因為脫水進行到后期組織邊緣與組織內部的細胞結合水大量流出，細胞膜破裂，細胞結構發生塌陷使各個位置的細胞面積大小均勻，無明顯差異。由圖可知D位置的面積具有明顯的增減變化。30～60 min，由15 000 μm2降至13 493 μm2；60～120 min，由13 493 μm2增至15 938 μm2最后到達16 126 μm2，這兩個階段主要與細胞膨壓損失和細胞壁張力有關。第一個階段隨著脫水的進行，膨壓趨于降低，細胞壁拉伸程度減小，整個細胞尺寸減小。大氣對細胞有一個顯著的正膨脹壓力，使細胞形狀保持橢圓形。然而。由于脫水的影響，細胞壁收縮，這有助于減小單個細胞的面積。第二個階段細胞壁張力減小，并且經歷較高程度的翹曲和起皺，以適應較低的細胞流體體積，細胞面積增加。

圖6 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞面積

圖6(b)所示為8 ℃時不同位置下的細胞面積。對比圖6(a)和(b)可知，180 min時二者細胞面積范圍分別為5 000～7 000 μm2以及3 000～5 000 μm2。說明8 ℃下的面積變化大于0 ℃下的面積變化。即較高的溫度會導致面積減少速率增大。這主要是由于膨壓、細胞壁收縮和組織結構塌陷等快速變化。

圖7所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細胞圓度。0 ℃時0～180 min，細胞圓度分布在0.85～0.95。8 ℃ 時0～120 min，細胞圓度分布在0.80～0.90。這與P. P. Lewicki等[13]認為植物細胞最常見圓度值為0.84和H. R. Bolin等[18]在Granny Smith蘋果的顯微結構表征中發現細胞的圓度值為0.82相符。這些數據表明植物細胞的形狀接近于橢圓形。圖7(a)中240 min時細胞圓度顯著降低說明細胞偏離圓的程度較大，細胞形狀變形較大可能由于膨壓損失以及細胞間隙不規則性的快速增加。相關文獻[19-20]曾報道細胞間隙會影響細胞形狀的變化。中心細胞的圓度遠大于其他位置，說明細胞變形是廣泛的和不規則、不均勻的。孔隙的產生會使形狀更加不規則，變形更明顯。此階段中心細胞的孔隙比其他位置的孔隙少，因此中心細胞變形較小。對比組織的圓度值可知，最后所得樣品的圓度值略小于新鮮樣品的圓度值，這與文獻[21-22]報道的趨勢相似。圖7(b)中180 min時細胞圓度顯著降低且中心細胞的圓度遠大于其他位置，與圖7(a)相比，細胞圓度在更短的時間內有更明顯的下降。說明脫水溫度會影響細胞圓度的變化趨勢。溫度越高，細胞圓度減少越明顯，可能與溫度加快水分遷移進程和細胞結構高度變形以及細胞骨架坍塌有關。

圖8所示為0 ℃和8 ℃溫度下不同位置的細胞伸長率變化。由圖8(a)可知0 ℃時脫水過程中不同時刻的細胞最大伸長率在D位置處出現，說明此時主軸長大于次軸長。而8 ℃時無明顯規律，但30 min時細胞的伸長率有顯著的減小。對比圖8(a)和(b)可知，0 ℃時細胞伸長率集中分布在1.2～1.8，8 ℃時細胞伸長率集中分布在1.2～1.9。8 ℃時曲線波動的幅度更大。即脫水溫度會影響細胞的伸長率，溫度較高時，曲線波動略大，文獻[7]中也觀察到相似的伸長率趨勢。8 ℃時的細胞圓度與伸長率比0 ℃時的分布范圍更廣，說明8 ℃時細胞經歷了更大的收縮。然而分析尺寸參數時0 ℃不同位置下的相對變量遠大于8 ℃下的相對變量，可知8 ℃時脫水過程中細胞形狀整體變化趨勢更均勻一致。這是因為在較低的溫度下，樣品需要更多的時間從材料中去除水分，導致樣品的整體變化比在高溫下處理的樣品更不均勻一致[23]。

圖8 0 ℃和8 ℃時不同位置下的細胞伸長率

4 結論

本實驗對蠶豆種子細胞進行數形分析，以研究水分遷移路上不同位置的細胞微觀結構的變化規律，得到以下結論：

1)脫水過程中，與尺寸直接相關的細胞參數(相對直徑、相對周長、相對面積以及面積)有顯著的變化分布規律。細胞相對直徑、相對周長以及相對面積的變化趨勢一致，但相對面積變化更大。對面積而言，組織邊緣細胞的面積小于組織內部的，上組織邊緣細胞的面積最小。與細胞形狀相關的參數(伸長率、圓度)隨機分布在一個范圍內，未觀察到顯著的規律性變化。0 ℃時，細胞圓度大體分布在0.85～0.95，細胞伸長率集中分布在1.2～1.8。8 ℃ 時，細胞圓度大體分布在0.80～0.90，細胞伸長率集中分布在1.2～1.9。

2)脫水溫度會影響尺寸參數以及形狀參數的變化。0～30 min，溫度越高，各個位置的尺寸參數變化越大。0 ℃時最大尺寸參數變化量呈現在D位置處。8 ℃時最大尺寸參數變化量呈現在C位置處。與0 ℃相比，脫水過程中8 ℃時的細胞經歷了更大的收縮，細胞形狀整體變化趨勢更均勻一致。