原發性EB病毒感染患兒AIM2炎癥小體通路的表達及與肝損傷的相關性

金龍騰，孫妍，黃基紅，溫正旺，石海礬，陳益平

溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 兒童感染科，浙江 溫州 325000

EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）是非嗜肝病毒感染引起肝損傷的常見病原體，原發性EBV感染患者中有70%～90%合并有肝損害[1]，而EBV感染導致肝損傷的機制較為復雜，其中免疫炎癥反應起著重要作用[2]。固有免疫是機體抵御病原微生物入侵的第一道防線。黑素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2, AIM2）是細胞質雙鏈DNA（double stranded DNA, dsDNA）感應蛋白，可識別外來病原菌或者自身細胞質內異常存在的DNA，并觸發炎癥體級聯反應的激活，導致炎性細胞因子[白細胞介素（interleukin, IL）-1β、IL-18）]的成熟釋放，發揮促炎作用[3]。AIM2炎癥小體通路是否參與EB病毒感染導致肝損傷目前尚不明確。本研究擬分析原發性EBV感染患兒外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PMSCs）AIM2炎癥小體通路的表達變化，探討AIM2炎癥小體與肝損傷的相關性。

1 對象和方法

1.1 對象 收集2020年1月至2021年6月在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院住院治療的原發性EBV感染患兒82例為原發感染組，男42例，女40例，年齡（5.2±2.0）歲。參照兒童EB病毒感染相關疾病的診斷和治療原則專家共識（2021版）[4]，入院時EB-VCA-IgM和血清EBV-DNA檢測均陽性，按有無肝損傷分為肝功能異常組（52例）與肝功能正常組（30例），排除標準：①EBV以外的細菌、病毒、支原體、衣原體感染者；②除EBV感染外患其他原發性或繼發性致肝損傷患兒；③近期服用肝損傷藥物者；④惡性腫瘤性疾病、自身免疫性疾病、血液系統疾病及近期使用免疫抑制劑的患兒；⑤嚴重心、肝、腎及其他臟器功能異?；純骸Ｍ谶x取門診體檢EBV-IgG陽性（EB-VCA-IgG、EB-NA-IgG）而EB-VCA-IgM陰性的50例健康兒童為既往感染組，男25例，女25例，年齡（4.7±2.0）歲。門診體檢EBVIgG和EBV-VCA-IgM均陰性的50例健康兒童為對照組，男27例，女23例，年齡（4.6±1.9）歲。3組研究對象性別、年齡比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。原發性EBV感染肝功能異常的患兒在住院1周后復查肝功能，38例肝功能恢復正常，14例肝功能好轉。本研究通過醫院倫理委員會批準（編號：2021-K-125-01），所有研究對象監護人知情同意。

1.2 標本采集、處理 原發性EBV感染患兒于入院次日、既往EBV感染組及對照組于體檢當日抽取空腹靜脈血，EDTA抗凝管2 mL用以分離PBMCs?？鼓苋⊙?，加入等體積PBS混勻，再加入等體積人淋巴細胞分離液（北京索萊寶科技有限公司），1 500 r/min 離心20 min后出現分層，留取單個核細胞層，加入5倍體積PBS洗滌后離心留取沉淀，保存于-80 ℃冰箱。促凝劑管3 mL，3 500 r/min離心20 min分離血清，-80 ℃凍存。

1.3 AIM2、ASC和caspase-1的mRNA檢測 按TRIzol總RNA提取試劑盒（北京普利萊基因技術有限公司）說明提取PBMCs總RNA，使用紫外分光光度計測量總RNA純度和濃度。采用實時熒光定量PCR檢測AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達，引物序列見表1。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應條件：95 ℃，5 min，95 ℃，10 s，60 ℃，30 s，共40個循環，每個樣品設3個平行復孔。使用2-ΔΔCt計算AIM2、ASC和caspase-1的mRNA相對表達量。

表1 PCR引物序列（5’-3’）

1.4 IL-1β、IL-18蛋白及其他生化指標的檢測 采用ELISA法檢測血清中IL-1β、IL-18蛋白水平，試劑盒均購自上海研域化學試劑公司。其他常規檢測，包括谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、谷草轉氨酶（aspartate transaminase,AST）、EBV抗體、血清EBV-DNA檢測（檢測下限是5.0×102拷貝/mL），由我院檢驗科完成。

1.5 統計學處理方法 應用SPSS22.0統計軟件進行數據處理。正態分布計量資料采用±s表示，兩組均數比較采用獨立樣本t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析；非正態分布計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗，組間兩兩比較采用Nemenyi檢驗；相關性分析采用Pearson相關。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達及IL-1β、IL-18水平 原發感染組患兒外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA的表達量及IL-1β、IL-18水平均高于既往感染組和對照組（P＜0.05），既往感染組與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 原發感染組與既往感染組AIM2炎癥小體mRNA相對表達量和IL-1β、IL-18水平

2.2 肝功能異常組與肝功能正常組患兒AIM2、ASC和caspase-1表達及IL-1β、IL-18水平 原發感染組中，肝功能異常組、肝功能正常組患兒AIM2、ASC和caspase-1的mRNA表達量及IL-1β、IL-18水平均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；肝功能異常組相較肝功能正常組更高（P＜0.05），見圖2。

圖2 肝功能異常組與肝功能正常組AIM2炎癥小體mRNA相對表達量和IL-1β、IL-18水平

2.3 原發感染組患兒AIM2 mRNA表達與ASC、 caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18水平的相關性 Pearson相關分析顯示，原發性EBV感染患兒AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1 mRNA表達以及IL-1β、IL-18水平均呈正相關（r=0.718、0.729、0.548、0.529，P＜0.05），見圖3。

圖3 原發感染組患兒AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18的相關性

2.4 原發感染組患兒血清EBV-DNA載量與AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表達和IL-1β、IL-18水平相關性 Pearson相關性分析顯示，原發感染組EBV-DNA載量與AIM2、ASC、caspase-1 mRNA表達及IL-1β、IL-18水平均呈正相關（r=0.712、0.494、0.479、0.384、0.300，P＜0.05），見圖4。

3 討論

EBV是一種嗜淋巴細胞的DNA病毒，可出現全身多個系統受累，其中肝損傷是原發性EBV感染最常見的并發癥，但EBV導致肝損傷的發病機制目前尚不明確。目前的研究發現EBV只在肝臟的淋巴細胞核中檢測到，EBV沒有直接侵犯肝細胞、膽道上皮細胞和血管內皮細胞，其對肝臟的損傷可能是EBV感染后淋巴細胞浸潤和炎癥因子導致的免疫損 傷[2，5]。

炎癥小體是一種存在細胞胞漿中的蛋白聚合物，主要由模式識別受體（pattern recognition receptor, PRRs）、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosisassociated speck-like protein, ASC）以及 caspase-1前體組成。炎癥小體的激活可誘導多種細胞因子的產生，在固有免疫中發揮重要作用[3]。2002年首次提出AIM2炎癥小體，主要由AIM2、ASC以及pro-caspase-1組成，AIM2通過識別入侵機體的病原體的dsDNA組裝成炎癥小體，激活caspase-1介導細胞焦亡以及IL-1β、IL-18的成熟和釋放，參與機體抗感染免疫反應[6-7]。通過體外細胞感染模型發現土拉弗朗西斯菌、單核李斯特菌、肺炎鏈球菌、乙型肝炎病毒、鼠巨細胞病毒等病原體感染可激活AIM2炎癥小體[7]。最近有研究發現EBV感染可誘導人單核細胞中AIM2炎癥小體的激活及caspase-1依賴性IL-1β分泌[8]，但AIM2炎癥小體與EBV感染導致的肝損傷是否存在相關性，目前尚未見報道。本研究顯示，原發性EBV感染患兒外周血AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達量均顯著高于既往感染組及對照組，并且AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達水平及IL-1β、IL-18水平與EBV DNA載量有正相關性，提示AIM2炎癥小體通路可能參與了原發EBV感染過程。

炎性小體激活炎性細胞因子的產生和細胞焦亡對肝臟具有重要的生物學效應。目前發現炎癥小體參與非酒精性脂肪性肝病、乙型病毒性肝炎、肝纖維化和肝癌等肝臟疾病的發病機制[9]。HAN等[10]比較慢性乙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis B, CHB）與慢性丙型病毒性肝炎（chronic viral hepatitis C, CHC）患者活檢肝臟組織，發現CHB患者AIM2的表達顯著高于CHC，并且在HBV高載量組（HBV-DNA≥1×105拷貝/mL）中AIM2的表達高于HBV低載量組（HBV-DNA＜1×105拷貝/mL）。AIM2水平與CHB患者中caspase-1、IL-1β和IL-18的表達呈正相關，提示AIM2表達與CHB相關的炎癥反應相關。既往研究發現EBV感染引起肝損傷患兒體內免疫功能紊亂比肝功能正常組患兒更為明顯[11]。本研究顯示，原發性EBV感染患兒中，肝功能異常組AIM2、ASC和caspase-1 mRNA表達量及IL-1β、IL-18水平高于肝功能正常組，且AIM2 mRNA表達與ASC、caspase-1的mRNA表達以及IL-1β、IL-18水平均呈正相關，這表明EBV-DNA與AIM2炎癥小體結合后可能導致caspase-1的活化，并進一步促進IL-1β、IL-18的分泌，從而在EBV肝炎中發揮作用。

綜上所述，原發EBV感染患兒AIM2炎癥小體通路的表達發生改變，并且與EBV感染所致肝損傷存在相關性，這為EBV感染致肝損傷的治療提供了新的研究參考。