王茜 吳建春 駱瑩濱 方志紅 李雁

作者單位：上海中醫藥大學附屬市中醫醫院腫瘤科（上海市200071）

肺癌是世界上發病率第二的惡性腫瘤，但死亡率卻長期居于第一位[1]。空氣中有害物質和病原體等的侵害，導致肺部易受到慢性損傷和炎癥的傷害，這是肺癌發病率高的主要原因之一[2]。

氧化應激是由活性氧類、DNA 氧化、脂質過氧化和蛋白質氧化所介導的一種常見生理過程[3]。由于致癌因子的刺激、代謝活動的增強以及線粒體損傷等因素，氧化應激活動增加，導致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產生增多，腫瘤細胞比正常細胞面臨更大的ROS 壓力，氧化應激在腫瘤的發生發展中發揮重要作用。通過ROS 介導的一系列氧化應激活動，可以引發原癌基因和抑癌基因突變，促進腫瘤細胞增殖，并通過增加基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達促進腫瘤細胞轉移[4]。然而，氧化應激作用可以在抗氧化劑的處理下得到控制[5]。

一直以來，膽紅素被認為是血紅素分解途徑的最終產物，生物活性有限，其濃度的升高往往是肝臟疾病的標志。細胞通過膽紅素-膽綠素循環作用積極維持膽紅素在細胞內的平衡。膽紅素的濃度主要取決于氧化壓力的程度，一方面通過線粒體Cyp2A5 進行調節，另一方面通過尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyl transferase 1A1，UGT1-A1）對膽紅素進行葡萄糖醛酸化，導致膽紅素的水溶性增加并使其在膽汁中排泄[6]。膽紅素之所以被認為是最有效的內源性抗氧化劑，是因為其在體外和體內都能產生保護性的脂質過氧化[7]。有證據表明，膽紅素和膽紅素代謝的相關產物在一些細胞活動中具有重要作用，包括細胞生長、遷移、分化以及免疫反應的調控等[8]。膽紅素已被證實能夠阻止腫瘤細胞的生長，并誘導細胞凋亡[9]。間接膽紅素和膽綠素是芳香烴受體（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的強效內源性激活劑，AhR 作為一種配體，激活的轉錄因子可以作用于各種基因，參與膽紅素的生物轉化和運輸[8,10]。AhR信號通路參與細胞凋亡、T 細胞介導的免疫反應、細胞增殖和分化的調節[11-12]，其介導機制被證明有助于膽紅素的抗腫瘤作用[13]。血紅素加氧酶（heme oxygenase，HMOX）和膽綠素還原酶（biliverdin reductase，BLVR）是膽紅素代謝過程中的兩種關鍵酶，細胞內膽紅素-膽綠素循環由HMOX1/2 啟動，并由BLVRA/B維持[8]。除產生膽紅素外，BLVRA 以及HMOX1 可以從細胞膜轉入細胞核，以氧化應激誘導的方式激活多種信號通路[14-15]。膽綠素和BLVRA 還被證明可以調節蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），PKC 是一種與腫瘤發生相關的激酶[16]。因此，調節血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）及其代謝相關酶的水平或活性，可能成為預防或治療腫瘤的新手段。

目前，關于膽紅素在肺癌的臨床意義及其與腫瘤免疫的關系研究內容有限。TBIL 是否與肺癌的發生發展有關，以及血清TBIL 是否通過炎癥細胞影響肺癌患者抗腫瘤免疫功能的研究報道較少。本研究旨在通過分析非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者血清TBIL 與臨床病理特征的關系以及與炎癥細胞之間的相關性，探討其在肺癌發生發展中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

收集2017年3月至2020年12月于上海中醫藥大學附屬市中醫醫院就診的NSCLC 患者的臨床資料。納入標準：1）經病理診斷（組織學或細胞學）確診為腺癌或鱗癌；2）臨床資料相對完整；3）卡氏評分（Karnofsky，KPS）≥60 分。排除標準：1）確診除肺癌外的其他惡性腫瘤；2）合并嚴重肝腎功能不全。本研究經本院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 資料收集 記錄患者的臨床資料以及觀察指標，包括年齡、性別、吸煙史、疾病史等一般資料，以及腫瘤相關病理特征，如腫瘤大小及數目、患病時間、腫瘤分期（采用第8 版TNM 分期系統）以及生活質量評定（采用Karnofsky 評分表，按0～100 評分）；

1.2.2 觀察指標 所有研究對象均在早晨空腹采集靜脈血，進行血常規、生物化學指標、腫瘤標志物以及細胞免疫檢查。本研究記錄的數據為患者在本院第1 次就診時的檢驗結果。無病生存期（disease-free survival，DFS）通過電話或門診復診隨訪獲取。

1.3 統計學分析

采用SPSS 26.0 軟件進行統計學分析。計量資料使用Kolmogorov-Smirnov 檢驗是否服從正態分布，服從正態分布采用±s表示，獨立樣本非參數t檢驗比較組間差異；非正態分布的用中位數M（P25，P75）表示，Mann-WhitneyU檢驗進行組間比較。計數資料采用χ2檢驗。分類變量相關性分析采用Logistic 回歸分析，檢驗效能采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC）下面積評估。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 血清TBIL 水平與肺癌患者臨床病理特征的關系

經正態性檢驗，年齡、患病時間呈非正態性分布，其他均為計數資料，因此采用獨立樣本非參數t檢驗對332 例患者TBIL 水平及患者的臨床病理特征進行分析。結果顯示，TBIL 在不同性別中表達存在差異，但在不同年齡段無顯著性差異。在有無吸煙史患者中，TBIL 無顯著性差異；在腫瘤病理特征中，TBIL 在有無淋巴浸潤、有無遠處轉移以及不同TNM 分期患者中呈顯著性差異（P＜0.05），但不同腫瘤大小以及患病時間中TBIL 無顯著性差異（P＞0.05）。TBIL 水平與肺癌患者臨床病理特征關系見表1。

2.2 Logistic 回歸分析腫瘤分期的相關危險因素

根據腫瘤TNM 分期將患者分為（Ⅰ+Ⅱ期）組和（Ⅲ+Ⅳ期）組，二元Logistic 回歸分析與其相關的危險因素。結果顯示：性別、年齡和病程與腫瘤分期無明顯相關性；代謝組學相關因素中，血清TBIL、白蛋白、谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶和尿素氮水平與腫瘤分期顯著相關（P＜0.05）（表2）。通過ROC 曲線下面積評估TBIL 的檢驗效能，P＜0.05 時檢驗值有意義，其中，TBIL、白蛋白以及谷草轉氨酶與腫瘤分期的相關性有統計學意義（圖1）。

表2 二元Logitic 回歸分析腫瘤分期病情程度的影響因素

2.3 TBIL 與NSCLC 患者炎癥細胞的相關性分析

由于TBIL 在不同性別中差異分布，因此在男性和女性中分別進行分析。根據約登指數計算截點值，其中，男性TBIL 水平截點值為13.85 μmol/L，女性TBIL 水平截點值為9.85 μmol/L。將患者分為TBIL 高水平組和TBIL 低水平組，在NSCLC 患者中，男性患者TBIL 低水平組（27.85%）的淋巴細胞比例均值低于高水平組（31.60%），TBIL 低水平組（2.35）的中心粒細胞與淋巴細胞比值（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）中位數高于高水平組（1.76，P＜0.05）；女性患者中，低水平組（30.03%）的淋巴細胞比例均值TBIL 低于高水平組（32.85%），TBIL 低水平組的NLR、CD3、CD4 細胞比例均高于高水平組（P＜0.05，表3，4）。

表3 男性患者不同TBIL 水平炎癥細胞表達情況

2.4 TBIL 對早期NSCLC 患者DFS 的預后預測價值

TBIL 在早期肺癌中表達水平高于晚期患者，為驗證TBIL 是否能夠抑制肺癌細胞的浸潤和轉移，選取224 例早期NSCLC 術后患者進行隨訪，采用Kaplan-Meier 生存曲線和Log-rank 檢驗分析血清TBIL 對DFS 的預測價值，結果發現，在正常值范圍內，當女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 時，患者具有較好的預后（P＜0.05），但在男性患者中TBIL 水平與DFS 無顯著性相關（圖2）。

表4 女性患者不同TBIL 水平炎癥細胞表達情況

3 討論

膽紅素對于增加氧化壓力的疾病具有防御作用。在一項大型前瞻性隊列研究中，對2 662 例結直腸癌患者重復檢測肝功能指標，并持續10年隨訪。該研究結果顯示，血清TBIL 水平是影響結直腸癌發展和預后的獨立因素，較高的血清TBIL 水平與較低的大腸癌風險有關[17]。Horsfall 等[18]針對英國生物庫中的成年人開展了一項大規模孟德爾隨機法研究，結果顯示循環TBIL 每增加5 μmol/L，肺癌總發病率就會減少1.2/10 000 人/年。除此以外，在胃癌[19]、乳腺癌、心血管疾病[20]、胰腺炎[21]、代謝綜合征以及呼吸系統疾病[22]中，均有證據表明較高水平TBIL 可以降低患病風險，并與良好的預后有關，這種結果可能與膽紅素的抗氧化能力有關。臨床上將膽紅素用于肝功能評估，在肝細胞癌患者中，常用白蛋白-膽紅素（albumin-bilirubin，ALBI）評分評估患者肝功能障礙嚴重程度，ALBI 較高提示肝功能障礙。近年來多項研究報道，ALBI 與其他惡性腫瘤的預后可能存在一定關聯，如術前ALBI 評分與CA199 聯合可作為胰腺癌預后的一項預測指標[23]。TBIL 有助于篩查和預防血管病變，避免發生嚴重的并發癥，臨床中也將TBIL 認為是糖尿病血管并發癥的一個保護性因素[24]。

本研究中男性的中位數TBIL 水平為13.1 μmol/L，高于女性中位數TBIL 水平12.3 μmol/L，且差異存在統計學意義。這是由于男性的雌激素水平較低以及紅細胞周轉率較高，男性的TBIL 水平通常高于女性[25]。眾所周知，吸煙是導致肺癌的主要原因，香煙煙霧中的自由基和氧化劑對DNA 的氧化損傷是導致肺癌發展的主要途徑之一[26]。吸煙與血清TBIL 之間呈負相關，吸煙引起的炎癥反應和抗氧化過程能夠消耗膽紅素[27]。研究發現有吸煙史的人群中TBIL＞17 μmol/L 的人群比TBIL＜5 μmol/L 的人群肺癌發病率低[18]。本研究中有吸煙史的肺癌患者中位數TBIL 高于無吸煙史者，但無顯著性差異?？紤]是因為本次納入有吸煙史的病例僅77 例，占總樣本量的23.2%，樣本量偏差導致本次結果不具有代表性。

中性粒細胞和淋巴細胞都是炎癥反應的重要組成部分，中性粒細胞由骨髓造血干細胞產生，主要參與人體的急性炎癥反應，淋巴細胞由淋巴器官產生，是人體免疫應答功能的重要組成部分。研究發現，外周血的炎性細胞增多與腫瘤的發生發展有關。如中性粒細胞分泌轉化生長因子-β 和基質金屬蛋白酶2，通過改變腫瘤微環境促進腫瘤細胞生長和轉移，而淋巴細胞在宿主抗腫瘤免疫作用中起保護作用，淋巴細胞的增加有利于癌癥患者的預后[28]。慢性炎癥是癌癥的標志性特征之一，炎癥細胞可以釋放ROS，ROS 及其參與的氧化應激過程可以促進腫瘤細胞增殖、轉移、血管生成及耐藥[5,29]。大量研究數據表明，NLR 與腫瘤的發生發展密切相關，高水平NLR 往往預示著不良的預后情況[30]。本研究發現，在NSCLC 患者中，男性和女性患者的NLR 在TBIL 高水平組均低于低水平組。由此猜想，TBIL 與NLR 之間可能存在協同作用，共同在肺癌免疫調節中發揮抗腫瘤作用。另外，在女性患者中，CD3+T 細胞比例和CD4+T 細胞比例在TBIL 低水平組反而高于高水平組（P＜0.05）。有文獻報道，膽紅素對抗原提呈細胞和T 細胞能夠產生免疫抑制作用[31]。并且AhR 通路參與了T 細胞介導的免疫反應，對調節性T 細胞和Th17 細胞的分化具有調節作用[32]。

早期肺癌的治療主要是以手術為主。腫瘤的病理分期（TNM 分期）是重要的預后因素。本研究顯示，在有淋巴結轉移和遠處轉移的患者中，TBIL 水平較低，而不同腫瘤大小表達無顯著性差異。因此，筆者猜想：在腫瘤進展期，TBIL 作為內源性抗氧化劑可能被消耗。膽紅素除了抗炎、抗氧化作用，對血管損害也有一定預防作用。如膽紅素水平聯合血清C 反應蛋白可作為診斷肝癌合并大血管侵襲的早期標志物，根據這兩項指標的檢測值可以預估發生大血管侵襲事件的概率[33]。TBIL 水平可能與腫瘤的浸潤、轉移存在一定關系。另外，本研究隨訪了224 例早期肺癌術后患者的TBIL 水平及DFS，發現當女性患者TBIL＞9.85 μmol/L 時具有良好的預后，但在76 例男性患者中沒有發現相同的趨勢。目前，TBIL 單個指標或聯合其他指標已經用于一些疾病進展及預后的預測，臨床中也證明了通過補充抗氧化劑可以改善癌癥治療的不良反用[34]。本研究數據也再一次提示，當TBIL 處于較低水平（男性＜13.85 μmol/L，女性＜9.85 μmol/L）時，聯合抗氧化劑治療可用于改善治療效果。

以上多項結果提示適當升高的TBIL 可有效降低肺癌的進展風險，但目前還尚無切實可行的研究方案將膽紅素的抗氧化功能用于相關疾病的治療或預防。針對早期沒有發生淋巴結轉移或遠處轉移的患者如何預防復發轉移，膽紅素水平偏低患者給予抗氧化劑是否能夠延緩腫瘤的浸潤和轉移，尚需進一步研究。本研究為小規模的臨床資料回顧性分析，具有一定局限性。目前，大多數臨床研究也是通過診斷后收集的血液樣本進行循環代謝組學特征研究，這些數據可能受到化療、手術、生活方式等因素的影響而出現偏差，然而這些混雜因素沒有得到適當的控制[35]。因此，應對這些因素進行合理劃分，展開大型流行病學研究，進一步明確血清TBIL 對腫瘤發生發展的影響。