基于TAIL-PCR分析外源基因在小鼠精原細胞中的整合位點

馮美瑩，曾梓凡，鄺乃誦，溫淑樺，劉文華，王瑛華

（肇慶學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

外源基因在動物細胞中的表達受到很多因素影響，其整合位點會影響細胞的生長狀態(tài)及受體動物的表達效應(yīng)，確定外源基因的整合位點在轉(zhuǎn)基因動物的研究中非常重要[1].外源基因的整合是隨機的[1-2]，發(fā)生在細胞周期的不同階段時，其整合效率和轉(zhuǎn)入純度都不一樣[3].只有發(fā)生在染色體分離的DNA合成期，外源基因會均勻地整合到每一個細胞中；外源基因整合發(fā)生在細胞周期的其他階段時，則會發(fā)生嵌合[2].因此，在轉(zhuǎn)基因細胞的研究中，確定外源基因的整合位點是對外源基因表型研究和功能探討的前提條件.

在研究轉(zhuǎn)基因細胞外源基因的整合位點時，最直接和有效的方法是克隆轉(zhuǎn)基因整合位點及其鄰近宿主基因組的序列，并將其與宿主細胞的基因組堿基進行比對，進而確定其轉(zhuǎn)入宿主細胞的位置[4-5].然而，在進行PCR 擴增時，常常由于DNA 含量有限而增大檢測難度.熱不對稱交互式PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）技術(shù)可以不受DNA含量的限制，結(jié)合特異引物和簡并引物進行3輪PCR擴增，簡單有效快速地回收已知序列的鄰近DNA片段，進而分析外源基因在宿主基因組的整合位點[6-7].TAIL-PCR技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因動植物中實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因動植物外源基因的整合位點序列分析[3,6-7].本研究運用TAIL-PCR技術(shù)確定外源基因Cas9在小鼠精原細胞中的整合位點，探究外源基因整合位點的特征，為轉(zhuǎn)基因動物純合體的育種和外源基因定點整合的研究提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的材料來源如下：細胞總RNA提取試劑盒購于Tiangen公司，實時熒光定量PCR擴增Mix和E.coli-DH5a 感受態(tài)購于南京諾唯贊公司，pMD19-T 載體、DNA 聚合酶和凝膠DNA 回收試劑盒等購于Takara公司，細胞培養(yǎng)所用的試劑購于GIBCO公司，其他試劑購于廣州鼎國生物技術(shù)有限公司.載體測序由廣州艾基生物公司完成.

試驗所用溶液配方如下：細胞完全培養(yǎng)液中含有DMEM（Dulbecco’ s modified Eagle medium）、體積分數(shù)為10%的胎牛血清（FBS，F(xiàn)etal Bovine Serum）和4 mmol-谷氨酰胺；LB液體培養(yǎng)基中含有1 g酵母提取物、2 g蛋白胨、2 gNaCl和200 mL純凈水（其中添加20 mg氨芐青霉素可配成LA液體培養(yǎng)基，添加1.5 g瓊脂粉和20 mg氨芐青霉素可配成LA固體培養(yǎng)基）.

1.2 試驗方法

1.2.1 動物貼壁細胞培養(yǎng)

將細胞從液氮中取出，37℃水浴融化和離心后，加入完全培養(yǎng)基重懸細胞，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，置于5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).待細胞密度達到80%～90%時，加入2 mL胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止后，同樣是離心，棄上清，加入完全培養(yǎng)基重懸，完成傳代.

1.2.2 細胞基因組抽提

待細胞長滿后按上述步驟消化處理，磷酸鹽緩沖液（Phosphate Bufferd Saline，PBS）洗2遍后留下細胞沉淀.然后，加入蛋白酶試劑和細胞裂解液70℃熱處理10 min.接著，加入無水乙醇沉淀基因組，并利用吸附柱收集細胞基因組，漂洗液清洗吸附柱上的離子和蛋白殘留后，50 μL的TE緩沖液或dd H2O洗脫吸附柱上的細胞基因組，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.3 TAIL-PCR擴增

運用表1中的特異性引物和簡并引物按照劉耀光的反應(yīng)條件進行3輪半巢式PCR擴增[8].第一輪PCR反應(yīng)以小鼠精原細胞基因組DNA為模板，使用6個DNA熔解溫度（Melting temperature，Tm）為68℃的嵌套式特異性引物（Specific primer，SP）與4 個低Tm 的簡并引物（Arbitrary degenerate primer，AD）[8]隨機組合對外源基因3’ 下游和5’ 上游側(cè)翼序列進行PCR擴增.前一輪的PCR產(chǎn)物稀釋100倍用于后一輪PCR反應(yīng)，第二輪和第三輪分別使用特異性引物與簡并引物共有序列（AC引物）進行組合，使特異性的產(chǎn)物被選擇性擴增.

表1 PCR引物序列

然后，制作1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像分析儀分析3輪PCR 的擴增片段，并按照凝膠DNA微量回收試劑盒的操作回收第三輪PCR的特異片段，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.4 T載體克隆

首先，將回收的目的片段分別按照“pMD19-T Vector 1 μL、目的片段0.3 pmol，加水補充到5 μL后，加入5 μL的Solution I”的步驟將目的片段與pMD19-T載體進行連接，短暫離心后，置于16℃反應(yīng)30 min.然后，全量加入100 μL 的E.coli-DH5α感受態(tài)細胞中，冰上反應(yīng)30 min 后，42℃熱激60 s 且冰上冷卻3 min，并加入300 μL的LB培養(yǎng)液，置于37℃搖床（100～150 r/min）震蕩培養(yǎng)1 h.接著，取100 μL菌液涂布在含有氨芐青霉素的LA 固體培養(yǎng)皿中，37℃培養(yǎng)12～16 h.最后，在LA 固體培養(yǎng)皿上挑選單克隆菌落接種于300 μLLA 培養(yǎng)液中，在37℃搖床（220 r/min）中擴大培養(yǎng)3～4 h.

1.2.5 菌液PCR檢測

以1 μL的菌液為模板，使用M13通用引物和DNA聚合酶對菌液進行PCR鑒定，反應(yīng)體系如下（10 μL）：5 μL 2×Phanta Max Buffer、0.2 μL dNTP Mix、1 μL 菌液、0.4 μL M13 上游引物、0.4 μL M13 下游引物、0.2 μL Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（1 U/μl）和2.8 μL dd H2O.短暫離心后按照“95℃預(yù)變性3 min、95℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸30 s和72℃總延伸7 min”的程序進行，其中變性到延伸的步驟循環(huán)35次.隨后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，并挑選正確的菌落進行測序.

1.2.6 生物信息學(xué)分析

將測序序列拼接后分別在NCBI 用Blastn（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi PROGRAM= blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）和 在Ensembl 用BLAST/BLAT search（http://asia.ensembl.org/Mouse_sapiens/Tools/Blast）與小鼠基因組進行同源性序列比對，從而分析外源基因的整合位點.

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠精原細胞的培養(yǎng)

穩(wěn)定表達Cas9的小鼠精原細胞剛復(fù)蘇時呈圓形、懸浮的狀態(tài)，經(jīng)過3～4 h培養(yǎng)后開始貼壁生長，胞體向外伸出呈梭形或不規(guī)則形狀（如圖1），12 h后基本完成貼壁生長，細胞密度逐漸增大.由圖1也可以看出，穩(wěn)定表達Cas9的小鼠精原細胞不僅生長速度快，而且折光性好，細胞狀態(tài)良好.

圖1 小鼠精原細胞貼壁情況（標(biāo)尺=100 μm）

2.2 Cas9基因表達檢測

為了研究Cas9基因的轉(zhuǎn)入情況，我們以穩(wěn)定表達Cas9的小鼠精原細胞基因組作為陽性對照，未轉(zhuǎn)入Cas9的小鼠精原細胞基因組作為陰性對照，通過PCR擴增對結(jié)果進行分析.如圖2A 所示兩組細胞的基因組提取效果良好，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)細胞基因組條帶.通過對目的基因片段進行PCR 擴增后發(fā)現(xiàn)在500～750 bp 處，陽性對照中出現(xiàn)目的條帶，符合Cas9 引物設(shè)計時的長度639 bp 范圍，陰性對照中則沒有（圖2B）.由此可見，PCR 擴增所得的基因為目的基因，Cas9基因成功轉(zhuǎn)入到小鼠精原細胞的基因組中.

圖2 Cas9基因PCR擴增結(jié)果

2.3 陽性對照組的小鼠精原細胞基因組擴增

為了尋找Cas9基因轉(zhuǎn)入到小鼠染色體中的位置，將特異性引物與簡并引物結(jié)合起來利用TAIL-PCR技術(shù)對小鼠基因組進行擴增.設(shè)計特異性上游引物檢測時，結(jié)合簡并引物經(jīng)過3輪PCR后在第二個和第四個產(chǎn)物（圖3C的2和4）中出現(xiàn)特異性條帶（圖3A、B 和C）；設(shè)計特異性下游引物檢測時，結(jié)合簡并引物經(jīng)過3 輪PCR 擴增后4 個孔中均出現(xiàn)特異性條帶（圖3D、E和F）.這些都有可能是Cas9轉(zhuǎn)入到小鼠基因組的位置，將其回收后進行下一步的分析.圖3中A、B和C為特異性上游第1、2和3輪的PCR擴增，圖3中D、E和F為特異性下游第1、2和3輪的PCR擴增.其中，M表示marker，圖A和圖D的1、2、3和4分別是SP1和SPA1與4個簡并引物的擴增片段，圖B和圖E的1、2、3和4分別是SP2和SPA2與AC引物的擴增片段，圖C和圖F的1、2、3和4分別是SP3和SPA3與AC引物的擴增片段.

圖3 TAIL-PCR擴增結(jié)果

2.4 Cas9基因的染色體定位

為了進一步確認Cas9基因轉(zhuǎn)入到小鼠基因組的位置，我們將上述結(jié)果回收的片段連入T 載體中，通過PCR擴增篩選出陽性的單克隆菌落（圖4 A），并將其與小鼠基因組序列進行比對，從而分析其整合位點.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6個回收片段中，有2個（圖3F的1和2）是屬于小鼠基因組序列，其余的為載體序列（結(jié)果未展示）.經(jīng)過比對分析，這2個片段均定位在小鼠基因組的12號染色體中（圖4B 和C），這表明Cas9基因整合到小鼠基因組的12 號染色體上.圖4A 為特異性下游第二個片段的菌液PCR檢測結(jié)果，圖4B為特異性下游第二個片段的與小鼠基因組的比對結(jié)果，圖4C 為特異性下游第二個片段的定位到小鼠染色體位置.

圖4 Cas9基因的整合位點分析

3 討論與結(jié)論

在目前轉(zhuǎn)基因動植物整合位點的研究中，用于獲取轉(zhuǎn)入位點兩端未知基因組序列的方法眾多[2-4,9]，接頭PCR在酶解基因組中接上已知序列，可提高擴增效率，但特異性片段少，且操作步驟繁雜[10-11]；質(zhì)粒拯救需要完整地復(fù)制起點和抗性篩選基因序列，且產(chǎn)物過長，基因組自連接和克隆轉(zhuǎn)化的操作效率低，試驗難度大[12]；這2種方法并不適合用于探討外源基因在小鼠精原細胞中的整合位置.iPCR法較方便和費用低，常被用于載體構(gòu)建[13-15]、啟動子擴增[16]、外源基因整合位點分析[17-18]，但是iPCR需要對基因組進行酶切和環(huán)化，要求宿主基因組具有較高的濃度和純度，而且操作和結(jié)果不確定性高，時常出現(xiàn)沒有結(jié)果的情況.早期運用該方法研究外源基因轉(zhuǎn)入小鼠精原細胞的染色體位置時，常出現(xiàn)沒有結(jié)果或者基因組丟失的現(xiàn)象（結(jié)果未展示）.經(jīng)過多次嘗試無果后，本研究采用特異性高和操作簡單的TAIL-PCR法，利用特異性引物和簡并引物進行擴增，使用少量的宿主基因組也可以有效、快捷的找出外源基因的整合位置[6-7,19].在研究細胞永生化載體元件插入位置時，黃惠等擴增出永生化細胞基因組的側(cè)翼序列，將其與宿主基因組進行比對分析發(fā)現(xiàn)使細胞永生化的hTERT基因隨機整合于2號、4號、6號、12號、13號、21號染色體中[20].本研究利用TAIL-PCR同樣在有限的小鼠精原細胞基因組中克隆出外源基因整合到基因組的旁側(cè)序列，并發(fā)現(xiàn)其整合到第12號染色體中，為以后轉(zhuǎn)基因動物純合體的育種研究提供依據(jù).

此外，TAIL-PCR法常被廣泛應(yīng)用于克隆啟動子序列和基因全長[21-25]、擴增基因組側(cè)翼序列[26-29]、分析轉(zhuǎn)基因植物和動物的拷貝數(shù)和純合度[3,5,30-31]等領(lǐng)域中，并在轉(zhuǎn)基因細胞和動物中用于分析外源基因的整合位點及其對宿主生物功能的影響.在分析外源基因整合位點的純合性中，孔慶然等采用該技術(shù)成功在綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因豬中克隆出TgInS1（1 440 bp）、TgInS2（1 263 bp）和TgInS3（1 861 bp）這3 個整合位點，從而確定純合的轉(zhuǎn)基因豬[30]，這與本研究運用該技術(shù)在動物轉(zhuǎn)基因細胞中檢測外源基因轉(zhuǎn)入位置有著異曲同工之效，也對于以后研究轉(zhuǎn)基因動物的純合性有著重要的指導(dǎo)作用.同樣，TAIL-PCR還能有效應(yīng)用于外源基因整合在轉(zhuǎn)基因植物中的研究.運用TAIL-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，突變體黃瓜擴增的T-DNA側(cè)翼序列插入到參與氣孔開放過程的Bhp基因的第10個外顯子中[32]，抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米的外源基因整合到玉米基因組第5號染色體中[33]，擬南芥突變體基因組的突變發(fā)生在影響維管發(fā)育的基因At1g 52 910第2外顯子中[34].由此可見，在轉(zhuǎn)基因植物中同樣可以與本文一樣利用TAIL-PCR 在序列復(fù)雜的轉(zhuǎn)基因事件中鑒定出基因插入位置，而且利用TAILPCR技術(shù)能夠很好地分離已知基因的側(cè)翼序列，對于研究外源基因在轉(zhuǎn)基因動植物中的整合位點確認及相關(guān)生物學(xué)功能具有重要的意義.