Daxx蛋白、HSP90α、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體TfR在兒童急性髓細胞白血病中診斷價值的ROC分析

劉 斌 王盛華 王 倩

（河北醫(yī)科大學(xué)附屬河北省兒童醫(yī)院，河北 石家莊 050031）

兒童急性髓細胞白血病是較為常見的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，在臨床中又稱為血癌[1]。通常情況下，患兒祖細胞及造血干細胞多存在一定的惡性病變，導(dǎo)致細胞出現(xiàn)正常分化和增殖能力喪失，引起無控制性持續(xù)增殖并逐漸取代正常骨髓組織，且可隨血液分布于全身各處組織器官[2-3]。有學(xué)者指出，腫瘤細胞自噬與體內(nèi)鐵代謝關(guān)系密切，鐵蛋白降解與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（TfR）水平密切相關(guān)[4-5]。近年來，在神經(jīng)退行性疾病的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，鐵蛋白降解是通過自噬溶酶體途徑的觀點受到臨床的高度重視，這一觀點正好和急性白血病當中的自噬活性異常有關(guān)。Daxx、HSP90α（熱休克蛋白）在其他腫瘤疾病的診斷中被證實具有重要的臨床價值。但現(xiàn)階段Daxx、HSP90α及TfR在診斷鑒別評估兒童急性髓細胞白血病中的應(yīng)用仍鮮有報道，因而筆者對我院收治的兒童急性髓細胞白血病患兒作為研究對象，繪制ROC曲線分析Daxx蛋白、HSP90α、TfR在兒童急性髓細胞白血病中診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 經(jīng)我院倫理委員會批準，選取我院2016年10月至2020年6月我院收治的84例兒童急性髓細胞白血病患兒作為觀察組，同期選擇84例 健康體檢者作為對照組，觀察組中患兒男53 例（63.10%）、女31例（36.90%），年齡1～9歲，平均年齡（5.79±1.42）歲，形態(tài)學(xué)分布情況：M16例（7.14%）、M29例（10.71%）、M328例（33.33%）、M 47 例（8.33%）、M 524 例（28.57%）、M65例（5.95%）、M75例（5.95%），危險度分布情況：低危15例（17.86%）、中危24例（28.57%）、高危45例（53.57%）。對照組中男52例（61.90%），女32例（38.10%），年齡1～10歲，平均年齡（6.73±1.45）歲。患兒及家屬均自愿參與研究，并簽署知情同意書，經(jīng)本院倫理委員會批準本研究。兩組兒童的年齡、性別一般資料無明顯差異（P＞0.05），分組合理，具有可比性。本次所選84例研究對象，均在化療治療前統(tǒng)一支撐骨髓制備標本，接受治療病例均進行標準誘導(dǎo)方案化療。

1.2 納排標準 納入標準：①急性髓細胞白血病患兒經(jīng)病理學(xué)檢查確診。②年齡均＜18歲。③患兒入組間未接受化療、放療或手術(shù)方案等治療方法進行治療。④受試者均對本研究知情并簽署知情同意書。排除標準：①合并出現(xiàn)其他惡性腫瘤。②精神異常無法有效配合本研究。③存在嚴重內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。⑤受試者主動申請退出本研究，未參與到整個的化療治療中或直接放棄治療。⑥診斷結(jié)果顯示患兒為急性早幼粒性細胞白血病。

1.3 方法 本組研究中在所有受試者入組后采集其空腹靜脈血，操作步驟嚴格按試劑盒中提供的說明書進行。在清晨空腹時采用EDATA-K抗凝管收集兩組患者靜脈血約2 mL，隨后進行離心處理，離心條件為：5000 r/ min，4 ℃。離心10 min后搜集血清，置于-20 ℃ 冰箱保存待測。離心收集的血清采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測受試者血清中HSP90α及Daxx蛋白。使用密度梯度離心法篩選外周血中單核細胞，后制備細胞混懸液采用PCR法檢測細胞中TfR蛋白及β-actin水平，以 TfR/β-actin表示TfR蛋白表達水平，以患兒依照病理檢測結(jié)果的分組標準作為金標準，繪制ROC曲線分析各指標單獨及聯(lián)合診斷兒童急性髓細胞白血病的價值。

1.4 觀察指標 對比兩組患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平，并對比不同危險度患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平。統(tǒng)計各指標單獨應(yīng)用與聯(lián)合應(yīng)用時在鑒別兒童急性髓細胞白血病結(jié)果，并分析各指標單獨應(yīng)用與聯(lián)合應(yīng)用時鑒別兒童急性髓細胞白血病的敏感度、特異度及AUC。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 本研究中采用SPSS 20.0行統(tǒng)計學(xué)分析，采用[n（%）]及（±s）表示和分析計數(shù)資料，采用百分率及均值±標準差表示和分析計量資料，采用Logsitic回歸模型分析三指標聯(lián)合應(yīng)用的診斷價值，繪制ROC曲線分析各指標單獨及聯(lián)合應(yīng)用的診斷價值，P＜0.05則差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Daxx、HSP90α及TfR水平檢測結(jié)果 研究結(jié)果顯示，觀察組患兒血中Daxx、HSD90α及TfR水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患兒血中Daxx、HSP90α及TfR水平檢測結(jié)果對比（±s）

表1 兩組患兒血中Daxx、HSP90α及TfR水平檢測結(jié)果對比（±s）

2.2 不同危險度患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平 不同危險度患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平存在明顯差異（P＜0.05），按照從低至高順序排列為低危＜中危＜高危。見表2。

表2 不同危險度患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平對比（±s）

表2 不同危險度患兒的血清Daxx、HSP90α、TfR水平對比（±s）

2.3 各指標鑒別兒童急性髓細胞白血病結(jié)果 研究結(jié)果顯示，Daxx檢測鑒別為兒童急性髓細胞白血病共64例，HSP90α檢查鑒別為兒童急性髓細胞白血病共68例，TfR檢查鑒別為兒童急性髓細胞白血病共66例，聯(lián)合應(yīng)用鑒別為兒童急性髓細胞白血病共79例。見表3。

表3 各指標鑒別兒童急性髓細胞白血病結(jié)果對比

2.4 各指標診斷兒童急性髓細胞白血病價值結(jié)果對比 本組研究結(jié)果顯示，各指標聯(lián)合應(yīng)用鑒別診斷兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷敏感度、特異度及AUC均明顯高于Daxx、HSP90α及TfR單獨應(yīng)用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4及圖1。

圖1 各指標診斷兒童急性髓細胞白血病價值的ROC曲線圖

表4 各指標診斷兒童急性髓細胞白血病價值結(jié)果對比

3 討 論

急性髓細胞白血病是較為常見的嚴重惡性腫瘤，其給患兒本人及家庭均造成嚴重的心理和經(jīng)濟負擔(dān)[6]。據(jù)相關(guān)研究報道，2014年至2019年，兒童急性髓細胞白血病的發(fā)病例數(shù)呈現(xiàn)波動上升的趨勢；在形態(tài)學(xué)分布上，以M3型與M5型多見，分別為31.91%、28.19%；患兒發(fā)病年齡的高峰期集中在2歲左右；患兒在發(fā)病性別上的差異不大；冬季為兒童急性髓細胞白血病的高發(fā)季節(jié)；在危險度上，高危患兒占比最高達46.67%；放棄治療率從2014年的34.78%下降至2019年的23.73%，可見各家長對兒童急性髓細胞白血病治療的需求不斷升高[7]。目前臨床中在對該病進行治療時主要以消滅體內(nèi)惡性腫瘤細胞為主要原則，有效控制患兒體內(nèi)病變細胞數(shù)有效防止腫瘤細胞浸潤等[8]。早發(fā)現(xiàn)、早治療是目前臨床中對兒童髓細胞白細胞干預(yù)治療的重要途徑，如何有效實現(xiàn)盡早診斷具有十分重要的臨床意義[9-10]。

3.1 DAXX對兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷的價值 細胞凋亡是促進體內(nèi)細胞正常發(fā)育、分化及成熟的一個關(guān)鍵步驟，同時也在腫瘤疾病的發(fā)生及信息傳遞當中反映出相應(yīng)的臨床信息。DAXX對白血病細胞凋亡調(diào)控基因的分析，對白血病的發(fā)病原理及臨床治療都有著重要影響，DAXX蛋白免疫反應(yīng)的產(chǎn)物在細胞核內(nèi)，在檢測過程中結(jié)果一般呈陽性表現(xiàn)，對患者的臨床療效及反應(yīng)有著密切聯(lián)系，甚至關(guān)系到患者的預(yù)后康復(fù)效果[11]。DAXX全稱為death domain-associated protein，是細胞重要的功能蛋白，其與細胞的生長發(fā)育、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞凋亡及病毒感染等多種過程密切相關(guān)[12]。并且DAXX還能夠防止β-淀粉樣蛋白和α-突觸核蛋白的錯誤折疊、纏結(jié)以及胞外斑塊和胞內(nèi)包涵體的形成。有研究指出，Daxx是細胞中Fas下游重要通路，Daxx還可有效提高Fas的功能，調(diào)節(jié)細胞敏感性[11]。此外，有研究指出，Daxx是體內(nèi)重要的信號分子，其可有效傳導(dǎo)腫瘤壞死因子受體超家族成員的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[13]。在本次研究中顯示，與健康兒童相比，急性髓細胞白血病患兒血清Daxx水平明顯升高，分別為（6.12±0.92）μg/L、（3.11±0.78）μg/L，且隨著危險度的升高而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示急性髓細胞白血病的發(fā)生可促使血清Daxx水平升高。白細胞與眾多細胞一樣，也會受到Daxx蛋白的影響而增殖與生長，因此，在兒童的急性髓細胞白血病中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。有學(xué)者采用乙酰化抑制劑對急性髓性白血病細胞株干預(yù)后，結(jié)果顯示胞內(nèi)Daxx水平均處于異常降低狀態(tài)。

3.2 HSP90α對兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷的價值 HSP90家族為可溶性胞質(zhì)蛋白，是由具有不同基因編碼的兩種蛋白構(gòu)成，分別為HSP90與GP96。其中HSP90的C末端具有較小的含有豐富負電荷的區(qū)域，其分布情況與DNA雙螺旋中的磷酸基團相似，正是這一區(qū)域決定了HSP90是否通過影響DNA的結(jié)構(gòu)來進行激素受體以及癌基因產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。在人體中，通過判斷是否具有豐富谷氨酰胺片段將其劃分兩種異構(gòu)體，分別為HSP90α與HSP90β。HSP90α在細胞的生長發(fā)育調(diào)控過程中扮演重要角色，可有效調(diào)控腫瘤細胞內(nèi)多種蛋白功能，并參與腫瘤細胞的增殖、存活、凋亡及侵襲轉(zhuǎn)移等多個過程。HSP90α在體內(nèi)具有免疫佐劑效應(yīng)，能夠和多種腫瘤抗原肽相互結(jié)合，激發(fā)特異性主動免疫的活性狀態(tài)[14]。HSP90α（熱休克蛋白）在臨床中又稱之為應(yīng)激蛋白，是機體細胞在一些理化因素刺激后高效表達的一組蛋白質(zhì)，不能直接判斷是癌癥表現(xiàn)。如對檢測結(jié)果抱有疑慮，可配合化驗血，以及影像學(xué)檢查等方式才能判斷有無癌變，可以通過胃腸鏡、胸片、腹部彩超等檢查確定有無腫瘤包塊，必要時可篩查腫瘤標志物、病理穿刺活檢確診，不必引起盲目恐慌。此外，有研究結(jié)果顯示在腫瘤細胞內(nèi)的IKK、PI3K/Akt及NF-KB等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中均扮演十分重要的角色[15]。在本次研究中，觀察組患兒血清HSD90α水平（3.93±0.64）μg/mL明顯高于對照組（0.32±0.07）μg/mL，且隨著危險度的升高而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。這提示著急性髓細胞白血病的發(fā)生可促使血中HSD90α水平升高。在急性髓細胞白血病患兒體內(nèi)，因機體受到疾病刺激，激發(fā)特異性主動免疫的活性，使得患兒血中HSD90α水平升高。

3.3 TfR對兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷的價值 鐵是體內(nèi)多種蛋白的輔助關(guān)鍵分子，有效參與體內(nèi)多種蛋白的代謝活動及功能。一般情況下，鐵代謝平衡在機體內(nèi)扮演十分重要的角色，當機體出現(xiàn)鈣超載后可導(dǎo)致白血病細胞生長，出現(xiàn)鐵剝奪后則可促進細胞凋亡。鐵是體內(nèi)許多蛋白質(zhì)的關(guān)鍵輔助分子，是維持人體疾病新陳代謝的關(guān)鍵因素，如果鐵超載可促進白血病細胞的生長，抑制其凋亡，是腫瘤發(fā)生和信息傳遞的重要媒介[16-17]。轉(zhuǎn)鐵蛋白（Tf）的主要作用是攜帶鐵運輸，由肝細胞與單核巨噬細胞合成，將鐵元素輸送至全身的各個組織，并將暫時不同的鐵元素輸送至儲存部位。TfR屬于膜受體，形成TfR-Tf-Fe復(fù)合物，通過胞飲方式進入細胞后，釋放鐵元素，隨后TfR-Tf回到細胞表面，TfR的數(shù)量反映著機體對鐵元素的需求量。血清中可溶性TfR絕大部分是以TfRTf的復(fù)合形式存在。因此，在鐵的轉(zhuǎn)運、吸收及代謝過程中，TfR扮演十分重要的角色，TfR可介導(dǎo)鐵的內(nèi)化過程，當體內(nèi)出現(xiàn)多余的鐵后通過TfR將其內(nèi)化吸收并以鐵蛋白形式在細胞內(nèi)保存，因而TfR常被作為評估細胞代謝水平的重要指標。有研究結(jié)果顯示，鐵超載是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生及發(fā)展的重要高危因素，在乳腺癌、頭頸腫瘤等多種腫瘤中均可見鐵代謝異常，因而TfR常被作為評估機體蛋白代謝平衡和預(yù)測腫瘤的重要指標[18-19]。急性白血病的發(fā)病和體內(nèi)鐵代謝紊亂及白血病細胞自噬活性的轉(zhuǎn)變有著一定聯(lián)系，但在以往的臨床研究中，對于急性白血病發(fā)病中鐵代謝紊亂的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不明確。本次研究顯示，觀察組患兒血中TfR水平（1.89±0.34）mg/L明顯高于對照組（0.25±0.07）mg/L，且隨著危險度的升高而升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。提示著急性髓細胞白血病的發(fā)生可促使血中TfR水平升高。該結(jié)論與許惠敏[20]等的研究結(jié)果具有相似之處，在其研究中顯示，白血病患兒與健康兒童的血清TfR水平分別為（3.26±0.62）mg/L、（2.13±0.19）mg/L。急性髓細胞白血病患兒機體鐵處于高度代謝的狀態(tài)，腫瘤細胞增殖與分化的過程中需要消耗患兒體內(nèi)的大量鐵元素，故而急性髓細胞白血病患兒的血清TfR水平顯著升高，促進鐵元素向腫瘤細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運。

3.4 Daxx、HSP90α、TfR聯(lián)合對兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷的價值 研究結(jié)果顯示，觀察組患兒血中Daxx、HSP90α及TfR水平明顯高于對照組。表明相比于正常的健康兒童，急性髓細胞白血病患兒存在明顯的Daxx、HSP90α及TfR水平升高現(xiàn)象，這3項指標對診斷急性髓細胞白血病具有一定價值。繪制ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，Daxx、HSD90α及TfR各指標聯(lián)合應(yīng)用鑒別診斷兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷敏感度、特異度及AUC分別為94.05%、95.24%、0.988，均明顯高于Daxx、HSP90α及TfR單獨應(yīng)用（敏感度分別為76.19%、80.95%、78.57，特異度分別為82.14%、79.76%、78.57%，AUC分別為0.831、0.815、0.822），且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。表明3項指標單獨應(yīng)用于對急性髓細胞白血病的鑒別診斷時具有其一定的局限性，而各項指標均有其各自優(yōu)勢，聯(lián)合用于急性髓細胞白血病鑒別診斷時可提升診斷效果。分析認為，通過聯(lián)合檢測患兒血中Daxx、HSP90α及TfR水平的檢測分別在評估患兒體內(nèi)細胞代謝、腫瘤細胞增殖、鐵代謝及內(nèi)分泌系統(tǒng)功能時具有各自的優(yōu)勢，進而3項指標聯(lián)合診斷時發(fā)揮了各項指標的評估優(yōu)勢作用，使得對兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷的效果顯著提升，提高其臨床診斷價值。但是急性髓細胞白血病的發(fā)病過程較為復(fù)雜，參與機制較多。在后續(xù)的臨床研究當中，還需要進一步探索白血病的發(fā)病機制，尋找到新的治療靶點，反復(fù)對白血病患者的發(fā)病機制和耐藥性質(zhì)進行深入研究，對反復(fù)發(fā)作的患者進行遠期跟蹤，記錄患者經(jīng)治療后的預(yù)后恢復(fù)狀況和生存率，為日后的白血病臨床治療提供進一步的臨床參考。

綜上所述，聯(lián)合檢測Daxx蛋白、HSP90α、TfR在兒童急性髓細胞白血病鑒別診斷中可有效提高診斷價值。但本研究臨床樣本數(shù)較少，有待后續(xù)繼續(xù)深入確認分析。