肝癌外周血單核細胞表面TLR2、TLR4水平與小腸細菌過度生長的關系研究

王 楠 李夢華 張錦偉

（大連市公共衛生臨床中心（大連市第六人民醫院），遼寧 大連 116031）

原發性肝癌（primary carcinoma of the liver，PLC）作為一種發病率較高的惡性腫瘤，會嚴重威脅患者的生命安全[1]。目前，該疾病主要分為膽管細胞癌、肝細胞癌與混合型3種類型。其中，肝細胞癌占PLC的85%～90%。肝癌的病理學基礎為病毒感染等各種致癌因素所誘發的肝纖維化、肝臟慢性炎癥與肝硬化。據流行病學顯示，我國80%～90%的肝癌患者均有HBV感染病史，慢性炎癥的持續刺激在肝細胞癌的發生、發展中也起著十分重要的作用。目前，肝癌診療技術研究取得了較大的進展，靶向藥物治療方案也在持續完善，臨床療效總體大幅度提升，但仍舊無法達到理想的治療效果。為此，臨床工作者應深入探究肝癌的發病機制，尋找出一種更加有效的治療方法。相關研究報道顯示，慢性肝病患者在發病期間存在小腸細菌過度生長現象，內毒素血癥的發生率明顯高于健康人群[2]。同時，慢性重型乙型肝炎外周血單核細胞TLR2、TLR4的表達明顯升高[3-4]。本次研究選取了3組觀察對象，主要就肝癌外周血單核細胞表面TLR2、TLR4水平與小腸細菌過度生長關系展開了研究與報道。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對象為2017年3月至2019年3月在我院治療的45例乙肝相關性肝癌患者與35例慢性乙肝型肝炎患者以及15例健康體檢患者，將其分別設為研究組A 45例，研究組B 35例，參照組15例。研究組A，男30例，女15例，平均（42.20±10.60）歲；研究組，男25例，女10例，平均（45.20±9.50）歲；參照組，男10例，女5例，平均（49.90±8.80）歲。患者自愿簽署知情同意書。3組組間比較差異無統計學意義，P＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 Alexa Fluor?488 mouse Anti-HUMAN CD282、Alexa Fluor?488 mouse IgG1 Κ、PE mouse Anti-Human TLR4（CD284）、PE mouse IgG1、APC Mouse Anti-Human CD14、紅細胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司）；顯色基質鱟試劑（上海榕柏生物技術有限公司）；乳果糖口服液杜密克[Abbott Biologicals B.V.（荷蘭）]。

1.2.2 主要儀器 流式細胞儀，FACSCalibur（美國Becton Dickinson公司）；SC-2546低速離心機（濟南存昌生物技術有限公司）；EC60Gastrolyzer型氫呼氣檢測設備（上海億人環保科技發展有限公司）；HWC-52型恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；分光光度計（北京京創泰寧偉業科技發展有限公司）；BIO-RAD680酶標儀（北京泰澤嘉業科技發展有限公司）。

1.2.3 小腸細菌過度生長檢測 采血當天受試者接受乳果糖氫呼氣檢測。要求患者在檢測前一晚禁食奶制品與豆制品等食物，確保患者保持隔夜空腹長達12 h以上。患者于測試當日晨起完成刷牙、排便，飲用溫水50 mL。禁止吸煙、劇烈活動，保持統一坐姿。

檢測人員于檢測前認真校正檢測儀器，檢測氫氣濃度時，要求患者保持空腹，口服乳果糖10 g，飲50 mL溫開水，隔15 min檢測1次，不間斷檢測2 h。具體值以患者每次呼氣后，顯示屏上數字停止變動為主，每次最少2次。若基礎呼氣濃度＞20 ppm，或者90 min內任何一個峰值＞基礎值20 ppm，SIBO為陽性，＜基礎值20 ppm為陰性。

1.3 觀察指標 ①觀察、對比3組SIBO陽性率、外周血內毒素濃度。②比較研究組A合并SIBO陽性組與SIBO陰性組外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4。③對比研究組A外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4表達水平與外周血內毒素相關性。

1.4 統計學分析 研究數據用SPSS 21.0統計學軟件處理，計數資料、計量資料分別用χ2、t檢驗，P＜0.05，證明比較數據有意義。

2 結果

2.1 SIBO陽性率比較 研究組A：陽性33例，陰性12例，陽性率73.33%；研究組B：陽性10例，陰性 25例，陽性率28.57%；參照組：陽性1例，陰性14例，陽性率6.67%；研究組A的SIBO陽性率明顯高于研究組B與參照組（χ21=38.735，χ22=74.305，P＜0.05），研究組B的SIBO陽性率高于參照組，差異有統計學意義（χ2=11.391，P＜0.05）。

2.2 外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4所占的比例的比較 與研究組B與參照組比較，研究組A的外周血CD14+單核細胞表面TLR2+、TLR4+細胞所占比例明顯較高（P＜0.05）；研究組B的細胞所占的比例與參照組比較，差異有顯著性（P＜0.05），見圖1。

圖1 研究組A、研究組B與參照組外周血CD14+單核細胞表面TLR2+、TLR4+細胞所占比例流式檢測圖

2.3 外周血CD14+單核細胞表面TLR2+、TLR4+細胞GMF比較 對比研究組B與參照組，研究組A的外周血CD14+單核細胞表面TLR2+、TLR4+細胞GMF明顯較高（P＜0.05）；研究組B的外周血CD14+單核細胞表面TLR4+細胞GMF參照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），而TLR2+細胞GMF無顯著性差異（P＞0.05），見圖2。

圖2 研究組A、研究組B與參照組外周血CD14+單核細胞表面TLR2+、TLR4+細胞GMF的流式檢測圖

2.4 外周血內毒素濃度比較 研究組A的血漿內毒素水平均顯著高于研究組B與參照組，（P＜0.05）；乙肝肝癌合并SIBO陽性者內毒素水平明顯高于SIBO陰性患者，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

2.5 研究組A外周血CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4表達水平與外周血內毒素相關性比較 研究組A的TLR2+細胞的比例、GMF與內毒素濃度呈正相關（r值分別為0.372、0.461，P＜0.05）；研究組A的TLR4+細胞比例、GMF與內毒素濃度呈正相關（r值分別為 0.651、0.804，P＜0.05）。

3 討 論

現階段，基因和細胞因子水平是乙肝病毒與肝癌關系研究中的重點，且多項報道稱，免疫系統介導的炎性反應與腸道微生態的改變在慢性肝病進展中具有十分重要的作用，這就促使免疫因素與炎癥成為該領域的研究重點。

表1 各組間CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4的表達及內毒素的比較（±s）

表1 各組間CD14+單核細胞表面TLR2、TLR4的表達及內毒素的比較（±s）

注：研究組A與參照組對比，aP＜0.05；研究組A與研究組B對比，bP＜0.05；研究組B與參照組比較，cP＜0.05；研究組B SIBO陽性與陰性比較，dP＜0.05；研究組A SIBO陽性與陰性比較，eP＜0.05。

在正常細胞發生癌變的過程中，由細菌與病毒微生物引發的慢性炎癥發揮著重要作用。一般情況下，約70%流入肝臟的血液來源于腸道-門靜脈系統，此路徑會提供多種機會讓肝臟接觸到攜帶有腸源性病原微生物的代謝產物。通常情況下，受肝臟自身免疫耐受這一特點的影響，肝臟并無明顯的炎性反應，但當免疫耐受遭受到破壞后，異常免疫反應就會表現出來，引發各種肝臟疾病。有研究顯示，TLRs參與了宿主抗病原微生物的免疫應答過程，與病毒性肝及肝癌之間具有明顯的相關性，在肝病診治中具有較高的研究價值。TLRs作為重要的模式識別受體家族成員，在多種腫瘤細胞表達中，TLRs受體均有體現。同時，因乙肝病毒等因素誘發的慢性持續性肝損傷，也可通過TLRs對DAMPs、PAMPs進行識別，在天然免疫中發揮免疫監視的作用，或者也可通過APC，觸發獲得性免疫，在獲得性免疫與天然免疫中發揮橋梁作用。另外，TLRs在其生理、病理過程中也有參與表現，如促肝纖維化，防止上皮損傷，促腫瘤生長，抗凋亡，促進上皮再生及生長與血管生成等。肝臟中的肝細胞、肝竇內皮細胞、樹突狀細胞、庫普弗細胞、肝星狀細胞等均可表達出多種TLRs。在最近幾年里，有學者在腸-肝軸研究中發現，腸道微生態在慢性肝病發展為肝癌的過程中極有可能發揮著十分重要的作用，這也為肝癌治療提供新的思路與方法。

本次研究數據結果顯示，研究組A患者的外周血內毒素濃度明顯高于研究B與參照組；SIBO陽性患者的內毒素水平，相比于SIBO陰性患者，明顯較高，與外周血單核細胞表面TLR2、TLR4水平呈正相關。因人體肝臟內的Kupffer細胞可以將內毒素清除[5]。特別是慢性肝病患者的肝功能損傷嚴重時，其清除肉毒素能力會明顯被削弱，導致內毒素大量進入血液循環系統，引起內毒素血癥[6-7]。再加上患者小腸內的細菌過度生長，菌群代謝速度加快，腸黏膜屏障功能就會遭受到不同程度的破壞[8]，內毒素也會發生位移，促使SIBO陰性患者體內內毒素水平顯著低于合并SIBO患者[9-10]。另外，毒素脂多糖具有TLRs激動劑的作用，可以誘導My D88與TLRs之間發生相互作用[11-12]，充分刺激下游NF-κB信號途徑，進而產生炎性介質，加快肝癌細胞增值，提高肝癌細胞存活率[13]。由此可知，TLR2、TLR4信號通路介導的炎性因子在疾病發生與發展過程中均發揮著十分重要的作用[14-15]。

綜上所述，在診斷與治療肝癌與慢性乙型肝炎過程中，病毒感染是TLR2、TLR4高表達的初始因素，內毒素上調單核細胞TLR2、TLR4的表達參與了SIBO的發生，單核細胞表面TLR2、TLR4水平的表達上調則會引發SIBO，由此可知，TLR2、TLR4與SIBO等相關因素之間是互相作用的[16]，且在慢性乙型肝炎向肝癌發展期間發揮著較大的作用[17-18]。為此，在治療肝癌的過程中，要從調節腸道菌群，阻斷TLR2、TLR4的炎癥信號通路這兩大方面入手[19]，以此來抑制慢性肝病的進程，減緩向肝癌的發展速度[20]，但由于此項研究內容還不夠成熟，處于試驗研究階段，因此需要大量的臨床試驗與充足的樣本進行進一步的驗證。