金納米簇化學發光體外生物檢測應用研究進展

夏天昊 王云鵬 戴曉茹 凌世生 陳 東 喬旭升* 樊先平

(1.浙江大學材料科學與工程學院 硅材料國家重點實驗室，浙江 杭州 310027；2.杭州安旭生物科技有限公司，浙江 杭州 310011)

1 引 言

體外生物檢測技術是指在生物體外利用特定的試劑和設備來檢測生物體中某種或某一類物質的方法，是免疫分析的重要組成部分[1]。傳統的體外生物檢測使用熒光標記法[2]，該方法需要借助外界光源，檢測耗時較長。為提高檢測效率，需要開發一種新的分析方法。化學發光(Chemiluminescence，CL)是指利用化學反應產生發光的現象[3]，其中通電引發電化學反應而產生的化學發光又稱為電化學發光(Electrochemiluminescence，ECL)[4]。普通的化學發光由反應試劑的混合即可引發，而電化學發光是由電極上生成的氧化型或還原型自由基與其他物質反應產生。在化學發光檢測系統中，最常用的兩種納米材料是量子點和金屬納米顆粒，其中發光效率較高的量子點通常含有重金屬元素，生物相容性較差[5]；而金屬納米顆粒的發光效率偏低，難以滿足精確檢測的要求。基于化學發光原理，研發兼具生物相容性和高效發光性能的新型體外生物檢測用發光材料，已成為當務之急。

金納米簇(Gold nanoclusters，Au NCs)是指尺寸一般在2 nm 以下、由數個至數百個金原子所組成的團簇[6]，擁有類似于量子點的量子限域效應和表面效應[7]，具有熒光強度高、光穩定性強、表面活性高等特點[8-9]。雖然金納米簇和金納米顆粒都是由金單質連接表面配體構成，但前者的熒光性能要遠遠優于后者。現在，金納米簇的化學發光現象也已得到證實[10]，并廣泛應用于血漿、尿液、組織液等的分析檢測中，檢測對象可以是氨基酸、多巴胺和各類小分子藥物，也可以是蛋白質、DNA、RNA 等生物大分子，檢測靈敏度(最低檢測限)相比于傳統的熒光標記法提高了數個數量級。

金納米簇合成方法簡單，生物相容性好，適合體外檢測的實際應用。發展基于金納米簇化學發光的新型體外生物檢測技術，既能保證檢測精度，也有利于提高檢測效率。本文將闡述金納米簇的制備方法、結構、性質及其化學發光原理，并結合近年來在體外生物檢測方向的應用進展，總結該體系在實際應用中面臨的關鍵問題與解決方案，最后對金納米簇在體外生物檢測領域的發展趨勢做出展望。

2 金納米簇合成方法、結構與性質

2.1 金納米簇合成方法

金納米簇的表面配體在合成過程中引入，配體主要分為小分子和大分子兩類，它們將合成原料(一般使用HAuCl4)中的Au(Ⅲ)還原成Au(Ⅰ)或Au(0)，并作為模板和保護層，借助結合錨點的作用來控制金納米簇的粒徑以及單個團簇所含的金原子個數。

以小分子有機物作為配體合成金納米簇，能在表面形成保護層，從而將晶體生長固定在較小的尺寸。應用于生命科學領域的金納米簇，配體多為含有硫元素的羧酸、氨基酸或多肽，如谷胱甘肽(GSH)[11-12]、硫辛酸(LA)[13]、N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)[14-15]、蛋氨酸(Met)[16]等。

大分子配體則能作為合成金納米簇的模板，它們的結構中含有各類功能性基團，并帶有一定量的電荷，包覆在金納米簇的表面，限制其粒徑。典型的蛋白質類配體是牛血清白蛋白(BSA)，其多肽鏈中含有大量的巰基，能與金原子以化學鍵(Au—S)的方式直接相連，并且作為一種還原劑促進金單質的生成。Xie 等[17]于2009 年最早報道了合成BSA-Au NCs 的方法，所合成的顆粒中包含25 個金原子，能發射出紅光。

一些高分子聚合物也可以作為合成金納米簇的輔助模板，如聚酰胺-胺(PAMAM)[18]和聚乙烯亞胺(PEI)[19]。與上述兩類配體不同，這些聚合物模板多為高度分支化的樹枝狀結構，雖然也能還原金元素，但更重要的作用是作為支架對尺寸較大的金納米顆粒刻蝕，得到金納米簇。

2.2 金納米簇結構

金納米簇中的金原子呈核殼結構排列，即少數原子組成核心，其余的原子圍繞核心逐層包覆，形狀接近于球形或多面體形[20-21]。表面配體是金納米簇的重要組成部分，對其物理化學性質有重要的影響。表面配體的結構包含以下三要素[22](圖1):首先，配體能與金原子以較強的共價鍵結合成錨點，這一部分通常含有C、P、S、Se四種元素之一；其次，配體的主體部分由烷基鏈、苯環或氨基酸鏈構成，通過共軛效應、空間位阻效應和電子轉移來提高金納米簇的化學穩定性[23]；最后，配體上所連接的與環境直接接觸的官能團，它們是金納米簇功能化的關鍵，能改變其親疏水特性，有的官能團還能提供與其他物質結合的位點，擴展其應用范圍[24]。

圖1 金納米簇與表面配體結構(以巰基乙酸為例)[22]Fig.1 The structure of Au NCs and surface ligands(Mercaptohexanoic acid is used as an ligand example)[22]

2.3 金納米簇性質

金納米簇之所以受到世界各國學者們的關注，是因為這種材料集多種優良性質于一體，克服了傳統納米發光材料的諸多不足，應用前景廣闊。金納米簇具有下列特性:

(1)量子限域效應:金納米簇的分子級尺寸使其擁有和量子點材料相似的性質，尤其是量子限域效應，能使金納米簇中費米能級附近的電子能級離散[25]。這樣，就能夠通過調控金納米簇的粒徑來改變其熒光波長。

(2)表面效應:金納米簇通常僅包含十幾個至幾百個金原子，這就意味著大部分原子位于金納米簇表面。又由于表面結構一般會產生缺陷，位于表面的原子通常配位數不足，所以金納米簇擁有比金納米顆粒更高的活性，這也是其表面容易鍵合各種配體的原因[26]。

(3)生物相容性:具有生物活性的蛋白質、多肽、氨基酸、核酸等都能作為配體與金納米簇表面活性位點結合[27]，使金納米簇與生物體環境接觸時，不會產生明顯的刺激作用。

(4)催化活性:金納米簇的顆粒形狀不規則，比表面積大，具有較高的表面能，在配體保護提高化學穩定性的同時，也能夠加快化學反應速率，體現出極高的催化活性[28]。

(5)高量子產率與光穩定性:金納米簇的能級結構使其容易接受外界所傳遞的能量而發光，量子限域特性又決定了其具有較高的量子產率(一般可達10%以上)[29-30]，并且發光更加穩定，在較長時間內不會發生閃爍[31]。

3 金納米簇化學發光原理

化學發光分為兩種類型，第一類是化學反應生成物作為發光物質，吸收反應釋放的能量躍遷至激發態，然后返回基態并發光；第二類是化學反應生成物作為中間體，吸收能量并將其轉移給另一種熒光物質，該熒光物質躍遷至激發態再回到基態的過程發出可見光[32]。作為一種小尺寸的準零維材料，金納米簇本身具有優異的發光特性，在一定條件下能夠直接產生化學發光，也能作為化學反應能量轉移的受體，同時獨特的表面活性也賦予了其較強的催化性能，能促進傳統化學發光體系中反應的進行，增加發光強度。以下將分別討論金納米簇在化學發光體系中所起到的不同作用和相應原理。

3.1 金納米簇作為化學發光體

金納米簇作為發光體的體系一般基于電化學反應，該過程需要借助共反應物的作用，常用的共反應物有三乙胺(TEA)[33]、三丙胺(TPrA)[34]、N，N-二乙基乙二胺(DEDA)[35]、過硫酸根離子[36]等。在電化學反應中，共反應物在電極上被氧化或還原成帶電自由基，接著自由基與金納米簇反應，轉移電子與能量(部分體系中金納米簇也可在電極上發生電子轉移)，使其能級躍遷至激發態，最后多余的能量以光子形式釋放出來，即產生ECL 信號[33，36]。

近年來，研究者們對金納米簇ECL 機理的闡述逐漸深入。Peng 等[37]以NAC-Au NCs 為研究對象，探討了電化學反應的作用和價態對ECL 性能的影響，發現電化學還原反應能使金納米簇中部分Au(Ⅰ)還原為Au(0)，同時表面配體脫附，ECL 強度與Au(Ⅰ)的還原程度呈正相關，與表面配體無關，即表面層的Au(0)是金納米簇中產生ECL 行為的主體。Hesari 等[38]歸納了TPrA 為共反應物時，不同原子數和電性的金納米簇的ECL 規律(圖2)，證明了它們的發光來源于TPrA·自由基向金納米簇的LUMO軌道轉移電子，再通過HOMO-LUMO 能級躍遷釋放能量，來實現近紅外區域的ECL 發射。處于激發態的金納米簇電性和帶電量由電化學反應控制，其ECL 強度既與TPrA 濃度有關，又與電極電位有關。

圖2 Au25－/TPrA 體系可能的ECL 機理[38]Fig.2 Probable ECL mechanism of Au25－/TPrA system[38]

3.2 金納米簇作為能量共振轉移受體

化學反應所產生的能量被另外一種熒光物質吸收而產生發光的現象，屬于能量共振轉移(Resonance energy transfer，RET)的類型[39]。金納米簇尺寸極小、活性高、能級不連續，在吸收化學反應釋放的能量后易被激發，產生發光現象，即作為RET 受體。

Zhang 等[40]設計了一種基于氧化還原反應和RET 效應的CL 探針，BSA-Au NCs 和四氫呋喃過氧化物(THF-HPO)之間發生氧化還原反應，生成激發態中間體并產生CL 信號，接著BSA-Au NCs 又能接受中間體所傳遞的能量，提高發光強度；當金納米簇中摻雜有Cu2＋時，對發光的增強作用更加明顯。Zhu 等[41]研究了金納米顆粒功能化類石墨C3N4納米片(Au-g-C3N4，發光波長為460 nm)與GSH-Au NCs(發光波長為610 nm)之間的ECL-RET 行為，發現金納米簇修飾到固定有Au-g-C3N4的電極上時，最大發光強度所對應的波長由460 nm 變為610 nm，證實了金納米簇為ECL-RET 受體，測量得到能量轉移效率約為52.17%。

在RET 體系中，金納米簇并非都起到增強發光的作用，有時也能使發光猝滅。Cheng 等[42]建立了一種基于CdTe 量子點和金納米簇的ECLRET 傳感器，其中CdTe 量子點固定在電極上，而金納米簇與發夾DNA 相連接。他們的研究結果表明，使用連接酶將輔助性DNA 和microRNA固定在金納米簇所連的發夾DNA 上時，金納米簇與量子點之間的距離較大，RET 作用不明顯，ECL 強度較高；而若僅僅將microRNA 固定于發夾DNA 上，二者之間的距離減小，RET 作用增強，ECL 強度降低。

3.3 金納米簇作為化學發光增敏劑

傳統的CL 體系多使用有機熒光化合物，如魯米諾、異魯米諾、吖啶酯、光澤精等，也有四價鈰[Ce(Ⅳ)]、高錳酸鉀等強氧化性無機物。這些化合物的研究與應用已有數十年歷史，但它們都存在發光強度弱、量子效率不高、發光持續時間短等缺點，在物質檢測領域的應用受限[43]。如果能夠引入一種增強CL 作用的物質，將會使這些有機熒光物的發光信號更容易探測到，也能拓寬它們的應用范圍。金納米簇即是起到這種作用的理想增敏劑之一。

魯米諾是最早應用的有機熒光化合物之一，在金納米簇之前，尺寸較大的金納米顆粒已被證實能對CL 反應中自由基的產生和電子轉移過程起催化作用[44]。金納米簇的催化作用和金納米顆粒是類似的，Deng 等[45]研究了BSA-Au NCs 對魯米諾-H2O2體系CL 性能的影響，結果表明加入的金納米簇濃度適當時能夠使該體系CL 強度提高數十倍。金納米簇首先催化H2O2形成活性自由基，該自由基再進一步與魯米諾發生反應，最終經過多步反應后形成發光體3-氨基鄰苯二甲酸陰離子(3-APA*)。

除了魯米諾之外，金納米簇也能作為催化劑提高其他CL 體系的發光強度。He 等[46]發現了金納米簇對NaHSO3-H2O2體系的催化作用，該體系原本化學發光十分微弱，由的氧化產物分解而來的發光體產率很低，而金納米簇能夠催化的氧化反應，使CL 能夠直觀地觀測到，滿足體外生物檢測應用的要求。Yang等[47]則建立了堿性KMnO4-羅丹明B(RhoB)流動注射CL 體系，發現在加入金納米簇后發光強度提高了數倍，而CL 光譜中沒有出現新的峰，也沒有發生峰位的改變。他們認為這可能是金納米簇的催化作用所致，機理如下(ox 表示氧化態中間體):

3.4 金納米簇聚集誘導發光效應

聚集誘導發光(AIE)現象是指發光分子在高濃度溶液中，由于聚集作用使分子內基團的旋轉受到限制，分子運動損失的能量減少，以光子形式釋放的能量增加，發光強度也隨之增大的現象[48]。近年來，有不少研究證實，在CL 或ECL體系中，金納米簇在一定條件下也具有AIE效應。

Zhang 等[49]發現，在雙(2，4，6-三氯苯基)草酸酯(TCPO)-H2O2CL 體系中，GSH-Au NCs 能作為TCPO 與H2O2反應的RET 受體，吸收能量產生光信號。如果將反應體系中的水逐漸用乙醇取代，金納米簇之間的相互作用力增大而引發聚集，GSH 配體的運動受限，產生AIE 現象(圖3)，使發光強度進一步提高。Jiang 等[50]以磷酸腺苷(AXP)為配體制備了金納米簇，發現配體中的磷酸鹽基團能與二價金屬陽離子(Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋)穩定結合，形成水凝膠網絡結構，限制金納米簇在溶液中的自由運動，而產生AIE 現象，大幅提高ECL強度。

圖3 Au NCs 在RET 和AIE 效應共同作用下的CL現象[49]Fig.3 The CL behavior of Au NCs under RET and AIE effect[49]

4 金納米簇化學發光體外生物檢測應用

生命體中的蛋白質、核酸和部分小分子活性物質往往含量較低，通過常規分析方法很難達到要求的精度，一般需要使用化學發光免疫分析法來檢測。早在上世紀90 年代，雅培公司、拜耳公司所研制的商用CL 免疫分析儀就已投入使用，這類儀器采用魯米諾或吖啶酯作為CL 系統，實現對激素、蛋白質、藥物的檢測。后來羅氏公司發展出Ru(bpy)為發光體的ECL 分析儀，應用于抗原、抗體和生物小分子的精確檢測。金納米簇的CL(或ECL)強度受其所處化學環境影響較大，因此可作為化學發光免疫分析系統的理想材料，尤其是在體外生物檢測方面，已得到非常廣泛的研究和應用。下面將按照應用領域展開討論。

4.1 檢測蛋白質

利用金納米簇化學發光體系來檢測蛋白質，可分為兩種類型:第一種基于ECL 體系和抗原-抗體結合反應，即將兩種不同的抗體分別固定在電極和金納米簇上，待測蛋白質作為抗原與抗體偶聯，形成免疫復合結構，進而改變金納米簇的ECL 強度；第二種基于CL 體系，利用的是蛋白質與金納米簇表面配體的反應，使金納米簇的CL行為受到影響。

基于抗原-抗體反應的ECL 免疫分析主要應用于臨床檢測，檢測系統的靈敏度至關重要，為此需要提高發光強度。解決思路之一是調整金納米簇的發光波長，使其ECL 光譜峰值位于近紅外(Near-infrared，NIR)區域。Yu 等[51]報道了一種以Met 為配體的金納米簇，施加還原電位后表面平均價態有明顯的降低，在共反應物三乙醇胺(TEOA)和氧化電位的作用下，能產生波長約為835 nm 的ECL 信號，發光強度比傳統的BSA-Au NCs 高70 余倍。這種納米簇的ECL 波長相比熒光波長有很大程度的紅移，可能是由于兩種發光的激發方式有差異，并且金納米簇表面未完全鈍化。他們使用這種金納米簇構建夾心免疫傳感器來檢測甲胎蛋白(AFP)，原理如圖4 所示，當AFP與連接在電極和金納米簇上的抗體特異性結合時，ECL 強度大大提高，成為檢測依據。該傳感器的檢測限低至1.0×10－15g·mL－1，檢測范圍為3.0×10－15～1.0×10－10g·mL－1。

圖4 Met-Au NCs ECL 體系檢測AFP 原理[51]Fig.4 Mechanism of detecting AFP by Met-Au NCs ECL system[51]

另外一種方法是引入催化劑(或增敏劑)，同時將共反應物與催化劑、金納米簇偶聯。Jia等[52]將Fe2O3納米陣列作為ECL 催化劑，三(3-氨基乙基)胺(TAEA)作為共反應物，設計了一種用于檢測蛋白片段CYFRA21-1 的ECL 傳感器，并自行設計能與金納米簇和TAEA 同時連接的多肽配體MYH-10。Fe2O3納米陣列固定在電極上，與TAEA 分子偶聯的同時提供空穴給TAEA 的HOMO 能級，促進TAEA 與金納米簇的電子轉移；同時減少空間位阻，使ECL 發射限于分子內。MYH-10 與待測物抗體連接后，利用抗原-抗體的結合實現檢測。傳感器發光信號穩定，具有超低的檢測限(1.33×10－15g·mL－1)和較寬的線性檢測范圍(1.0×10－14～1.0×10－7g·mL－1)。

普通CL 體系檢測大分子物質的應用較少，現有的報道中檢測對象是起催化水解作用的酶。You 等[53]以TCPO-H2O2體系為能量供體，BSAAu NCs 為能量受體，建立了化學發光能量共振轉移(CRET)體系，用于檢測人體尿樣中的胰蛋白酶。TCPO 被H2O2氧化后形成不穩定的中間體1，2-過氧環乙烷雙酮，將能量傳遞給金納米簇使其產生強烈的發光，胰蛋白酶又能水解BSA，降低CL 強度。該體系線性檢測范圍為1.0×10－8～5.0× 10－5g·mL－1，檢測限為9.0× 10－9g·mL－1，且擁有良好的選擇性。

此外，也有基于DNA 雜交鏈來檢測特定蛋白質的ECL 傳感器的報道。Zhou 等[54]設計了一種能同時檢測MUC1 和CEA 的ECL 傳感器(圖5)，將BSA-Au NCs 分別與敏化劑Cu2O＠Cu 納米顆粒和TiO2納米片組裝，再與發夾DNA(A3、B3)連接形成探針；然后將另外一組發夾DNA(A2、B2)固定在電極上，分別雜交與癌胚抗原(CEA)、粘蛋白1(MUC1)相連的發夾DNA(A1、B1)。檢測過程中，A3、B3分別與A2和B2形成新的雜交結構，原有的A1和B1脫落，導致金納米簇的ECL強度發生變化。實驗結果表明，該ECL 傳感器能實現陰極與陽極發光，其中陰極發光由TiO2納米片催化，強度與CEA 濃度呈正比；陽極發光由Cu2O＠Cu 納米顆粒催化共反應物DEDA 的氧化而增強，強度與MUC1 濃度成正比。該傳感器檢測CEA 與MUC1 的靈敏度分別為4.3×10－13g·mL－1和5.8×10－15g·mL－1。

圖5 BSA-Au NCs 陰極與陽極ECL 信號產生及傳感器檢測CEA 和MUC1 的原理[54]Fig.5 Cathodic and anodic ECL emission of BSA-Au NCs and mechanism of detecting CEA and MUC1[54]

表1 歸納了近年來基于抗原-抗體反應或DNA雜交反應的金納米簇ECL 傳感器檢測蛋白質的相關報道。這些研究通過使用效率更高的共反應物[55]、引入其他類型的增敏劑[56-57]、引發鏈式反應[58]、構建ECL-RET 體系[40-59]等方法來提高金納米簇的ECL 強度和檢測靈敏度，實現對特定蛋白質的超靈敏檢測。另外，還可使用直接連接抗體的金納米簇搭建競爭性免疫分析平臺[60]。

表1 金納米簇ECL 免疫分析傳感器檢測蛋白質的應用Tab.1 Application of detecting protein by Au NCs ECL immunoassay biosensors

4.2 檢測核酸

核酸分子中含有硫元素，經還原后可形成與金納米簇結合的巰基，基于該原理和在4.1 節中提到的DNA 雜交反應，可建立檢測核酸的ECL傳感器。文獻[42]即為典型案例，該傳感器用于microRNA 的檢測，靈敏度為2.17×10－14mol·L－1，線性檢測范圍為1.0×10－13～1.0×10－7mol·L－1。

Huo 等[61]提出一種基于雙波長ECL-RET 的免疫分析傳感器，如圖6 所示。能量供體為固定在魯米諾-層狀雙氫氧化物上的金納米顆粒(Au NP-luminol-LDH)，受體為修飾有DNA 的金納米簇(Au NCs-DNA)，其中供體的ECL 光譜與受體的吸收光譜存在較大面積的重疊區域，RET 效率高。當引入雙鏈特異性核酸酶(DSN)和待測物microRNA 后，Au NCs-DNA 會從層狀雙氫氧化物表面脫落，這樣Au NP-luminol-LDH 的ECL 會增強，而Au NCs-DNA 的發光減弱。通過監控440 nm 和620 nm 處發光強度的比值能實現對microRNA的檢測，將待測物進行循環擴增后，檢測范圍為1.0×10－17～1.0×10－10mol·L－1，靈敏度可達9.4×10－18mol·L－1，其檢測限在所報道的microRNA 免疫分析傳感器中達到最低值。

圖6 microRNA 傳感器的雙波長ECL-RET 原理與檢測原理[61]Fig.6 The dual-wavelength ECL-RET and detecting mechanism of microRNA biosensor[61]

Liu 等[62]以Met-Au NCs 為發光體、TEA 為共反應物，設計了一種用于檢測人乳頭瘤病毒亞型(HPV-16)DNA 的ECL 傳感器，其中Met-Au NCs 與一段單鏈DNA 以Au—S 鍵連接，發光強度受到抑制。當環境中存在目標DNA 時，該DNA 能與含有RNA 片段的核酸切割酶(Cas12a-crRNA)中的堿基配對而交聯，激活酶的切割能力，減小Met-Au NCs 上所連DNA 單鏈的長度，ECL 信號增強。該傳感器的靈敏度為4.8×10－13mol·L－1。

4.3 檢測藥物和生物小分子

與蛋白質或核酸的檢測不同，檢測藥物和生物小分子主要基于金納米簇作為催化劑的CL 體系，對靈敏度的要求相對較低。小分子物質可與金原子或表面配體直接作用，通過促進或抑制催化過程來改變CL 強度。表2 總結了近年來檢測小分子物質的CL 傳感器的報道。

表2 金納米簇CL 生物傳感器檢測小分子物質的應用Tab.2 Applications of detecting small molecules by Au NCs CL biosensors

傳統的魯米諾-H2O2體系存在靈敏度低、穩定性和選擇性較差的問題，解決方法之一是使用能在水溶液中穩定的有機過氧化物代替H2O2來提供活性氧。Halawa 等[67]發現BSA-Au NCs 能夠水解青蒿琥酯分子中的過氧鍵，并基于此建立CL 傳感器。活性氧的存在能讓魯米諾的CL 強度顯著增加，而GSH 能與金納米簇以較強的共價鍵結合，抑制活性氧的產生，降低CL 強度，據此即可進行GSH 的線性檢測，靈敏度能達到nmol·L－1數量級(線性范圍為5.0×10－8～5.0×10－6mol·L－1，檢測限為5.2×10－9mol·L－1)。

在金納米簇的基礎上，也可以引入其他增敏劑實現協同增敏作用。Yousefzadeh 等[68]將石墨烯量子點(GQDs)和金納米簇加入到堿性KMnO4-羅丹明B 體系中，發現二者都能催化CL 反應的進行，RhoB 分子和活性中間體能吸附到金納米簇表面，加快能量傳遞過程，GQDs也能起到類似的作用。若采用GQDs/金納米簇復合體系，增敏效果比二者單獨作用更明顯。用該體系來檢測西咪替丁(圖7)，線性檢測范圍為8.0×10－10～2.0×10－7g·mL－1，檢測限為3.0×10－10g·mL－1。

圖7 基于AuNCs 與GQDs 協同增敏作用的CL 傳感器檢測原理[68]Fig.7 Detecting mechanism of CL biosensor based on synergetic catalytic effects of Au NCs and GQDs[68]

在ECL 體系中，可借助酶的催化作用使待測物水解，生成能影響發光強度的物質，實現間接測量。Zhang 等[69]設計了一種基于酶促反應的ECL 傳感器，以固定在CeO2納米線上的金納米簇為發光體，用于檢測乙酰硫膽堿(ATCl)。環境中的乙酰膽堿酯酶(AChE)可催化ATCl 轉變為硫代膽堿，硫代膽堿又能催化金納米簇與共反應物之間的電子轉移過程，提高發光效率，ECL 信號也得到明顯的增強。該傳感器的線性檢測范圍為5.0×10－10～4.7×10－4mol·L－1，檢測限為1.7×10－10mol·L－1。

總之，金納米簇在CL 和ECL 體系中的作用和檢測對象并不完全相同。在金納米簇參與的情況下，ECL 傳感器比CL 傳感器有更高的檢測精度，這是因為外加電流能促進化學反應的電子轉移，反應速率更快，從宏觀上來看就是發光強度的提高。雖然近幾年的研究中，金納米簇CL 和ECL 傳感器的檢測靈敏度逐漸提高，發光效率得到突破，但與其他類型的免疫分析傳感器相比，在穩定性和重現性方面研究仍然不夠深入，實際應用中的抗干擾能力也有待進一步提高。

5 結論與展望

金納米簇是一種具有量子效應的新型高效發光材料，表面配體是優化其性能的關鍵，配體以化學鍵形式與金納米簇結合，并作為還原劑和模板限制顆粒尺寸，使金納米簇在復雜的化學環境下保持穩定的性質，配體上的官能團又進一步使金納米簇功能化。金納米簇的化學發光主要有以下幾類:作為化學發光體在通電條件下與共反應物轉移電子而產生電化學發光；作為能量共振轉移受體而產生發光；作為化學增敏劑催化其他試劑的化學發光；在化學發光或電化學發光體系中，金納米簇在一定條件下也具有聚集誘導發光效應。金納米簇化學發光可用于蛋白質、核酸和小分子等的體外生物檢測，提高發光強度和檢測靈敏度是實際應用中的重點，主要有以下進展:在蛋白質的檢測中，施加還原電位能在金納米簇的LUMO能級注入電子，引入增敏劑能使共反應物的HOMO 軌道上產生空穴，兩種方案都能促進電子轉移過程，增強ECL 信號；在核酸的檢測中，將ECL光譜與金納米簇吸收光譜重疊的發光體作為能量供體，可提高ECL-RET 效率，結合循環擴增技術，可大大降低檢測靈敏度；在用于小分子物質檢測的魯米諾CL 體系中，以化學性質更穩定的有機過氧化物代替H2O2為活性氧來源，能提高光穩定性，同時CL 體系中還可以借助金納米簇與量子點的協同增敏作用改善檢測效果。

雖然已有多種改善金納米簇化學發光體系發光效率、提高檢測靈敏度的研究，但是要擴展其在體外生物檢測中的商業化應用，仍然需要在以下方面深入探討:

(1)在金納米簇制備方面，除了要保證方法簡單、制備成本低之外，還需要盡可能地提高其純度，避免外來雜質的影響，同時修飾有配體的金納米簇要做到尺寸均一、結構精確可控，能適應復雜的檢測環境；

(2)在金納米簇的CL 或ECL 機理方面，除了需要對發光過程和待測物對發光體系的影響進行解釋，還需要進一步探究納米簇濃度、溶液pH、溶劑種類、納米簇表面配體種類、納米簇尺寸與形狀等因素對發光強度的影響，并從動力學角度分析解釋；

(3)在體系的發光效率方面，可進一步結合最新的發光現象研究，如具有AIE 效應的金納米簇是一個有潛力的發展方向。當然，仍然需要繼續探索其他提高發光強度、靈敏度、穩定性、重現性和抗干擾能力的方法。

(4)在體外生物檢測應用方面，除了要注重檢測效果，還應研究含金納米簇的試劑與市售化學發光免疫分析儀的適配程度，為實際應用打下基礎。

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