Hg2+ 調控氮磷共摻雜碳納米點在半胱氨酸/同型半胱氨酸熒光檢測中的應用

路 露 徐 律 張 鑫 周小紅 余樂平

(1.無錫商業職業技術學院 汽車技術學院，江蘇 無錫 214153；2.鹽城工學院 材料科學與工程學院，江蘇 鹽城 224002)

1 引 言

半胱氨酸(Cys)作為一種代表性的小分子生物硫醇，可參與細胞內的許多氧化還原過程和肝臟內的磷脂代謝。Cys 具有保護肝細胞免受損傷、促進肝功能恢復的藥理作用[1]。正常細胞間Cys 量在30～200 μmol/L 范圍內[2]。生物體內Cys 的含量過多或過少都會增加疾病的發生幾率，包括肝損傷、胱氨酸病、心血管疾病甚至癌癥。同型半胱氨酸(Hcy)是另一種重要的含硫醇氨基酸，與Cys 相比，它多含一個亞甲基。Hcy 可直接或間接誘導血管內皮細胞損傷，引起血管平滑肌細胞增殖，影響低密度脂蛋白氧化，增強血小板功能，引起血栓形成。血清中正常Hcy 含量約為5～12 μmol/L[3]。如果濃度超出這個平衡范圍，可能會發生動脈損傷、激素問題和血栓的形成[4]。由于Cys 和Hcy 不可或缺的作用，制備靈敏、簡單且廉價的探針來準確測定生物系統中的Cys/Hcy 至關重要。

迄今為止，已有大量分析儀器，包括高效液相色譜、毛細管電泳、比色熒光法等被報道用于Cys檢測[5-7]。其中，熒光法因其操作快捷、無創、靈敏度高而被廣泛選用。近年來，貴金屬納米團簇、有機分子化合物和半導體量子點已被廣泛研究用于Cys 檢測[8-10]。但一些探針由于其生物毒性差、溶解度不理想以及對細胞膜的滲透性低等并不適用于細胞內Cys 檢測。此外，有機探針通常涉及繁瑣的合成程序。而“信號關閉”型傳感器往往會限制靈敏度。因此，迫切需要開發一種用于Cys/Hcy 檢測的、具有可忽略不計細胞毒性的環保型傳感器。

光致發光碳基納米點(CDs)由于其獨特的光學性質、超低細胞毒性、優異的光穩定性、綠色和簡便的合成路線而受到廣泛關注[11-12]。但單一的碳納米點往往熒光量子產率不高，且在干擾離子共存過程中對特定目標離子的選擇性較差，不利于實際應用。眾所周知，用雜原子摻雜CDs 可能對物理化學性質產生重大影響，例如，電子分布、表面懸鍵和化學反應性[13]。CDs 骨架中豐富的N 含量與高熒光量子產率有關。N 和P 都具有5 個價電子和類似的原子結構，更容易與C 原子鍵合。因此，N、P摻雜的碳量子點具有更加優異的光學性質。通常用作N、P摻雜的前驅體主要有三溴化磷、磷酸一鈉、磷酸、檸檬酸、尿素、多巴胺和鄰苯二胺等，然而它們存在摻雜量低、合成工藝復雜、靈敏度低和光穩定性低等問題，限制了它們的實際應用[14]。而葉酸(FA)和N-(膦酰基甲基)亞氨基二乙酸(PMIDA)無毒性，對環境友好，且FA 的富氮分子結構為提高N 的摻雜量提供了更多機會，PMIDA 分子中的羧基和磷酸基團很容易與FA 反應，而且PMIDA 的支鏈結構可能有利于碳化過程中碳骨架的形成。此外，FA 對癌細胞上的葉酸受體(FR)具有良好的親和力，具有很好的生物相容性。因此，FA 和PMIDA 作為N/P摻雜前驅體，可獲得高熒光量子產率、低細胞毒性和高細胞滲透性的N/P摻雜碳點，進而在Cys/Hcy 的熒光檢測中發揮重要作用。

鑒于此，本文采用葉酸(FA)和N-(膦酰基甲基)亞氨基二乙酸(PMIDA)，通過簡便且環保的水熱法制備新型N、P 共摻雜碳納米點(N，PCDs)，詳細探討了該碳納米點的元素組成、表面官能團和光學性質，并在不同條件下進行Cys 和Hcy 測定。此外，該體系已成功應用于BEL7402細胞和尿液樣本中的Cys 識別，通過細胞成像實驗探索了N，P-CDs 對于活細胞內的Cys 的識別能力，獲得了滿意的實驗結果，并探討了可能的傳感機理。

2 實 驗

2.1 藥品和儀器

FA(≥99.0%)、PMIDA(≥98.5%)和3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物(MTT)購買于Sigma-Aldrich。Hg(NO3)2·H2O、Cys、Hcy 和其他氨基酸(Gly、Ser、Val、Glu、His、Lys、Tyr 等)購買于國藥化學試劑有限公司。人肝癌細胞BEL 7402 來自中國科學院典型培養物保藏中心。含有青霉素和鏈霉素的細胞培養基(RPMI-1640)、生理PBS(pH ＝7.4)購自KeyGEN生物科技有限公司。胎牛血清(FBS)和胰蛋白酶購自碧瑤生物科技有限公司。

樣品的透射電鏡(TEM)照片采用JEM-2100F型號設備測定；樣品的X 射線衍射光譜(XRD)采用Bruker D8 型號設備測定；樣品的傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)采用Nicolet 5700 型號設備測定；樣品的拉曼光譜采用賽默飛公司設備測定，激發波長為532 nm；樣品的X 射線光電子能譜(XPS)采ESCALAB 250 型號設備測定；樣品的紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)和熒光光譜(FL)采用UV-2450 和F-7000 型號設備測定；樣品的熒光壽命和絕對熒光量子產率(PLQY)由FluoroLog3-TSCPC 型號設備測定；樣品的MTT 測定使用Multiskan GO 微孔板分光光度計(Thermo Fisher Scientific)進行；樣品的共聚焦熒光圖像由LSM 800(ZEISS)設備記錄。

2.2 樣品制備

將0.103 g FA 和0.075 g PMIDA 溶解在15 mL 水中以形成均勻的溶液。之后，將前體溶液移入25 mL 高壓反應釜中，然后在180 ℃下加熱2 h。冷卻后，將上清液以8 000 r/min 的速度離心20 min，使用去離子水進行透析(1000 u MWCO)24 h 以進行純化。60 ℃下真空干燥得到表征用固體產物。

2.3 實驗條件優化

在合成過程中，優化了FA 和PMIDA 的質量比(2∶1～2∶3)和反應時間(1～6 h)以獲得最佳光致發光效率。在測定過程中，在定量檢測前優化了激發波長(330～420 nm)和pH(3～12)。N，P-CDs 溶液用水或相應的緩沖液稀釋10 倍，然后加入微型比色皿中以測量熒光發射光譜。光電倍增管電壓為500 V，狹縫寬度為5 nm。

2.4 Hg2+和Cys/Hcy 測定

在測定過程中，將100 μL N，P-CDs 溶液(1.5 mg/mL)和50 μL 磷酸鹽緩沖液加入離心管中，然后吸取不同濃度的Hg2＋溶液，最終體積控制在500 μL。在370 nm 激發下測試溶液的熒光發射光譜。Cys/Hcy 檢測:將100 μLN，P-CDs 溶液、50 μL 緩沖液和100 μL Hg2＋溶液(625 μmol/L)加入離心管中，然后加入不同濃度的Cys/Hcy 溶液，加入去離子水，最終體積控制在500 μL，進行FL測定。在選擇性研究中，將100 μL N，P-CDs 溶液、50 μL 緩沖液、100 μL Hg2＋(625 μmol/L)、其他干擾氨基酸(5 mmol/L)和適當的水混合均勻。通過計算F/F0值，評估了N，P-CDs 對Cys/Hcy的敏感性和選擇性。

2.5 真實樣品測定

采用標準添加方法，以自來水和尿液為真實樣品。將不同Hg2＋含量(2，10，50 μmol/L)添加到去離子水中，并且在添加前后測量FL，根據線性方程評估個體濃度。對尿樣中的Cys(100 nmol/L、60 μmol/L、100 μmol/L)進行了類似的程序以評估回收率。

2.6 細胞毒性試驗

將BEL 7402 細胞轉移到96 孔板中。每個孔包含大約5×103個細胞。將細胞用RPMI-1640培養基和10% FBS 培養24 h 以實現細胞貼壁生長。然后每個孔用PBS 沖洗3 次，并加入新制備的培養基，其中包含不同濃度(0～400 μg/mL)的N，P-CDs。孵育一天后，沖洗孔并單獨加入含有600 μg/mL MTT 的新鮮培養基。培養4 h 后，用100 μL DMSO 代替原MTT 溶液，振蕩10 min，然后用微孔板分光光度計記錄570 nm 處的吸光度。細胞活力根據如下公式計算:

其中，V代表細胞活力，At為經N，P-CDs 處理后細胞的吸光度，Ac為對照細胞的吸光度。

2.7 細胞成像

將BEL 7402 細胞加入共聚焦培養皿中，培養24 h 以實現貼壁生長。然后丟棄漂浮的細胞，用PBS 沖洗粘附的細胞。隨后，補充N，P-CDs (150 μg/mL)并再孵育30 min。去除多余的N，PCDs，再次沖洗培養皿，用共聚焦激光掃描顯微鏡記錄細胞圖像，再將N，P-CDs 處理的細胞加入Hg2＋(125 μmol/L)中10 min，沖洗并拍照。對于Cys 識別體系，將N，P-CDs/Hg2＋加載的細胞與外源性Cys(150 μmol/L)孵育30 min。

3 結果與討論

3.1 材料選擇與實驗優化

選擇FA 和PMIDA 作為前體主要基于以下因素:(1)FA 和PMIDA 都沒有毒性，這確保了合成過程對環境友好。(2)將N、P 雜原子摻雜到CDs 的骨架中可以帶來大量的活性位點，從而帶來更高的量子產率[15]。FA 的富氮分子結構為提高N 的摻雜量提供了更多機會，無論是邊緣的氨基形式還是碳框架內的雜芳環形式。(3)FA對癌細胞上的葉酸受體(FR)具有良好的親和力，可以被內化到細胞中。CDs 骨架中的FA 片段可能有利于活細胞中的進一步FL 檢測。(4)作為另一種電子供體，P 元素通常與N 結合制備CDs，以促進電子離域用作傳感位點。此外，PMIDA 分子中的羧基和磷酸基團很容易與FA 反應，而且PMIDA 的支鏈結構可能有利于碳化過程中碳骨架的形成。為了獲得最佳的熒光性能，我們對反應前驅體的質量比和反應時間進行了優化，如圖1 所示。結果表明，N，P-CDs 制備的最佳質量比為4∶3，最佳反應時間為2 h。

圖1 前驅體質量比(a)和反應時間(b)對N，P-CDs 熒光強度(λex ＝370 nm，λem ＝446 nm)的影響Fig.1 Influence of mass ratio of precursor(a) and reaction time(b) on the FL intensity of N，P-CDs(λex ＝370 nm， λem ＝446 nm)

3.2 N，P-CDs 表征

圖2(a)為樣品N，P-CDs 的TEM 照片，從圖中可以看出，碳點均勻地分散在支持膜上，形狀接近圓形，直徑約為5 nm。插圖為N，P-CDs 的粒徑分布圖，從圖中可知N，P-CDs 的粒徑呈現正態分布，其平均直徑為(4.3 ± 1.3) nm。從樣品的EDS 光譜(圖2(b))中可以看出，位于0.27，0.40，0.52，2.02 eV 的特征峰分別對應于碳、氮、氧和磷元素。圖2(c)為元素含量結果圖，值得注意的是氮的原子百分比為10.0%，高于其他相關文獻報道的CDs[16-17]，磷的原子百分比為1.12%。樣品的XRD 譜圖(圖2(d))顯示在22.8°處出現較寬衍射峰，表明碳點的形成[18]。

圖2 N，P-CDs 的TEM(a)、EDS(b)、元素含量(c)、XRD(d)、FT-IR(e)和拉曼光譜(f)。(a)中插圖為N，P-CDs 粒徑分布圖。Fig.2 TEM(a)，EDS(b)，elemental content(c)，XRD(d)，FT-IR(e) and Raman spectrum(f) of N，P-CD.The inset of Fig.2(a) is the size distribution of N，P-CDs.

為了進一步研究樣品的化學鍵和官能團，進行了紅外和拉曼表征。如圖2(e)所示，位于3 433，3 362，3 056 cm－1處的3 個吸收峰分別對應于O—H、N—H 和Ar—H 的不對稱伸縮振動；位于2 827 cm－1和2 792 cm－1處的相鄰峰與—CH2—和—CHO—(C—H)的振動有關；位于1 701 cm－1和1 603 cm－1處的兩個尖銳而強烈的峰與—C==O 和C==N 的伸縮振動一致；位于1 365，1 293，1 176，1126 cm－1的4 個峰與C—N、C—O、P==O和P—O 的振動相關[19]。這些結果表明，除了如羥基、氨基和其他共軛基團這些大多數CDs 中常見的化學基團外，本文所制備樣品中有磷酸基團的存在。拉曼光譜用于檢測分析N，P-CDs 的骨架結構。如圖2(f)所示，位于1 346 cm－1和1 594 cm－1的兩個特征吸收帶，前者屬于D 帶，后者屬于G 帶，分別對應于sp3雜化碳原子和面內sp2雜化碳原子。另外，ID/IG比值為0.66，證實樣品中存在大量由碳化過程和氮、磷摻雜引起的懸空鍵。

XPS 表征用于分析N，P-CDs 化學組成與元素價態。圖3(a)為C 1s 的XPS 光譜，位于284.4，285.1，286.1，288.2 eV 處存在4 個擬合成峰，分別對應于C—C/C==C、C—N/C—P、C—O 和C==O/C==N，這意味著主要的共軛結構為芳環和雜原子環以及表面的不飽和基團等[20]。圖3(b)為N 1s 的XPS 光譜，圖中顯示了三種氮組成:吡啶N、吡咯N 和N—H，進一步證實了氨基和酰胺基團分散在表面。圖3(c)為O 1s 的XPS 光譜，位于531.3，532.7，534.0，535.2 eV 處的特征吸收峰分別對應于C==O、C—OH/P—OH、P==O 和C—O—C 中的O[21]。圖3(d)為P 2p 的XPS 光譜，兩個特征吸收峰對應于P—C 和P—O，進一步表明了磷、磷酸鹽和亞磷酸的摻雜形式[22]。

圖3 N，P-CDs 的C 1s(a)、N 1s(b)、O 1s(c)和P 2p(d)XPS 光譜。Fig.3 C 1s(a)，N 1s(b)，O 1s(c) and P 2p(d) XPS spectra of N，P-CDs.

3.3 N，P-CDs 光學性質

圖4(a)為N，P-CDs 的UV-Vis 吸收光譜，最大吸收波長位于370 nm 處，在日光下顯示淡黃色，在370 nm 紫外光激發下，溶液發出一束藍光(如圖4(a)插圖所示)，最大吸收波長為446 nm，絕對FL 量子產率為23.64%。圖4(b)為330～420 nm 不同激發波長下的FL 性能結果圖。如圖4(b)所示，當溶液在370 nm 光源下激發時，最大發射波長位于446 nm，該波長被選為最佳測量波長。這種依賴于激發的行為與之前報道的光致發光碳點相似[17]。圖4(c)～(e)為pH、鹽濃度和儲存時間對最大發射波長下FL強度的影響。如圖4(c)所示，FL 強度在pH 值為5～10 中保持穩定。在極酸性和堿性環境下強度較低，主要是由于懸空鍵會受到質子化/去質子化過程的影響。從圖4(d)可知，即使NaCl濃度高達200 μmol/L 時，FL 強度仍保持不變，表明樣品具有優異的耐鹽性。圖4(e)表明樣品儲存30 d 后，FL 強度僅下降了5.8%，顯示出優異的穩定性。

圖4 (a)N，P-CDs 在370 nm 激發下的UV-Vis(曲線a)和熒光發射(曲線b)光譜，插圖為日光和370 nm 激發下的水溶液；(b)不同激發波長下的熒光發射光譜；pH(c)、離子強度(d)和儲存時間(e)對N，P-CDs 在446 nm(λex ＝370 nm)的FL 強度的影響(激發和發射狹縫寬度均設置為5 nm)。Fig.4 (a)UV-Vis(curve a) and fluorescence emission(curve b) spectra of N，P-CDs under 370 nm excitation，insets:aqueous solution under daylight and excitation of 370 nm.(b)Fluorescence emission spectra under different excitation wavelengths.Effects of pH(c)，ionic strength(d) and storage time(e) on FL intensity of N，P-CDs at 446 nm(λex ＝370 nm).Both excitation and emission slit widths were set at 5 nm.

3.4 Cys 和Hcy 的FL 檢測

圖5(a)為N，P-CDs(曲線a)和添加Hg2＋(曲線b)、半胱氨酸(曲線c)或同型半胱氨酸(曲線d)的FL 光譜。在暴露于Hg2＋后FL 急劇下降，在加入Cys 或Hcy 后，FL 發射從6.2%分別恢復到90.2% 和80.4%，插圖為相應的FL照片。隨后，通過添加不同濃度的Hg2＋來評估檢測性能。從圖5(b)可以看出，當添加的Hg2＋濃度增加到125 μmol/L 時，FL 逐漸猝滅，并且在很寬的范圍內(0.05～125 μmol/L)建立了線性關系(圖5(b)的插圖)。根據3σ/k計算，檢測限為20 nmol/L。如表1 所示，與其他Hg2＋的FL 探針相比，該檢測性能具有較為明顯的競爭力。如圖5(c)及其插圖所示，當在N，P-CDs/Hg2＋復合溶液(0～200 μmol/L)中加入適量Cys 時，FL 相應升高，Cys 濃度和F/F0在很寬的范圍內也獲得了良好的線性關系(0.1～150 μmol/L，F0代表初始FL 強度)。經計算，其檢測限為30 nmol/L，如表2 所示，與其他Cys 探針相比，顯示出相對出色的檢測能力。Hcy 具有與Cys 相似的分子結構，僅亞甲基不同。如圖5(d)所示，該納米探針也具有很好的靈敏度識別該分子(線性范圍:0.1～100 μmol/L，檢測限:50 nmol/L)。

表1 各種Hg2+熒光探針的比較Tab.1 Comparison of various Hg2＋fluorescent probes

表2 不同Cys 探針的比較Tab.2 Comparison of different Cys probes

圖5 (a)N，P-CDs(曲線a)和添加Hg2＋(曲線b)、半胱氨酸(曲線c)或同型半胱氨酸(曲線d)的FL 光譜，插圖為對應的FL 照片；(b)N，P-CDs 的FL 光譜；Hg2＋濃度增加時，N，P-CDs/Hg2＋與不同濃度的半胱氨酸(c)和同型半胱氨酸(d)。 λex ＝370 nm，激發/發射狹縫寬度為5 nm。Fig.5 (a)FL spectra of N，P-CDs(curve a) with successive addition of Hg2＋(curve b)，cysteine(curve c) or homocysteine(curve d).Insets:corresponding FL photographs.(b)FL spectra of N，P-CDs with increasing concentrations of Hg2＋.N，P-CDs/Hg2＋with different concentrations of cysteine(c) and homocysteine(d). λex ＝370 nm，excitation/emission slit width is 5 nm.

3.5 可能的傳感機理

為了進一步探究傳感機理，針對Hg2＋加入和不加入的情況，探究了N，P-CDs 的FL 衰減和FL壽命，結果如圖6(a)～(b)所示。時間分辨譜使用雙指數函數擬合，N，P-CDs 的平均壽命為9.96 ns，而N，P-CDs/Hg2＋復合溶液的平均壽命為12.46 ns。兩個時間分辨衰變壽命τ1和τ2的貢獻分數顯示在圖6(b)中。FL 壽命的差異意味著Hg2＋引發N，P-CDs 的熒光猝滅可能更傾向于遵循動態猝滅機制[38-39]。鑒于此，我們推測了可能的傳感機理，圖6(c)為本文所制備N，P-CDs 的制備過程及傳感機理圖。本文以FA 和PMIDA 為原料制備了N，P-CDs。由于Hg2＋與N，P-CDs 表面的活性基團結合，處于激發態的N，P-CDs 通過電荷轉移將電子給了Hg2＋，使N，P-CDs 的熒光猝滅[40-41]。而當體系中加入半胱氨酸/同型半胱氨酸(Cys/Hcy)時，由于Hg2＋和硫醇基團之間更強的相互作用，誘導了Hg2＋離子的釋放，因此熒光猝滅的N，P-CDs/Hg2＋體系顯示出off-on 趨勢。這種“開-關-開”過程中的形態變化可通過TEM來進行分析，結果如圖7 所示。與N，P-CDs 的良好分散狀態(圖7(a))相比，N，P-CDs/Hg2＋系統表現出聚集狀態(圖7(b))。然而，當將Cys 添加到該系統中時，形態又恢復到良好的分散狀態(圖7(c))，與上述推測的機理一致。

圖6 (a)FL 衰減(黑點:N，P-CDs，紅點:N，P-CDs/Hg2＋)；(b)N，P-CDs 中加入和沒加入Hg2＋的FL 壽命；(c)N，P-CDs制備過程及對Hg2＋和Cys/Hcy 的傳感特性示意圖。Fig.6 (a)FL decay(black dots:N，P-CDs，red dots:N，P-CDs/ Hg2＋).(b)FL lifetime of N，P-CDs with or without Hg2＋.(c)Schematic diagram of the preparation process of N，P-CDs and sensing property towards Hg2＋and Cys/Hcy.

圖7 N，P-CDs(a)、N，P-CDs/Hg2＋(b)和N，P-CDs/Hg2＋-Cys(c)的TEM 照片。Fig.7 TEM of N，P-CDs(a)，N，P-CDs/Hg2＋(b) and N，P-CDs/Hg2＋-Cys(c).

3.6 選擇性研究

Cys/Hcy 的選擇性是通過比較Cys/Hcy(100 μmol/L)與其他干擾氨基酸的FL 性能來評估的(5 mmol/L)。結果如圖8 所示，從圖中可以發現只有Cys 和Hcy 可以恢復N，P-CDs/Hg2＋的FL強度，其他氨基酸不會觸發FL 增強。主要是源于Cys/Hcy 具有—SH，與熒光猝滅的N，P-CDs/Hg2＋中的Hg2＋有更強的相互作用，進而恢復熒光，因此可選擇性的實現對Cys/Hcy 的靈敏測定，而對所述其他干擾氨基酸并不響應。這些結果可滿足體外測定和實際應用的選擇性要求。

圖8 N，P-CDs 對Cys/Hcy 及其他樣品選擇性研究結果圖Fig.8 Selectivity of N，P-CDs for Cys/Hcy over other species

3.7 真實樣品

鑒于實際應用的需求，本文采用自來水和尿液驗證實際樣品中N，P-CDs 檢測Hg2＋和Cys的可行性，并采用加標法計算回收率。如表3 所示，Hg2＋測定的回收率在96.69%～104.50%范圍內，測量RSD 低于4.36%。如表4 所示，尿液中Cys 的測定回收率在96.81%～104.61%之間，RSD 低于5.39%。這些結果表明基質可能的干擾可以忽略不計，具有較為廣闊的實際應用潛力。

表3 自來水中Hg2+的測定Tab.3 Determination of Hg2＋in tap water

表4 尿樣中Cys 的測定Tab.4 Determination of Cys in urine sample

3.8 N，P-CDs 的細胞毒性

由于細胞成像具有敏感的傳感特性，有望用于N，P-CDs 的Cys 測定。為此我們進行了MTT 測試以分析不同劑量N，P-CDs 下BEL 7402 的存活率。如圖9 所示，隨著N，P-CDs 濃度的增加，細胞活力雖呈下降趨勢，但即使添加的N，P-CDs 濃度高達150 μg/mL 時，BEL 7402 的存活率仍保持在80.4%，因此，選擇該濃度用于隨后在BEL 7402 細胞中的FL 測定。

圖9 BEL 7402 細胞在不同濃度的N，P-CDs 下孵育24 h的存活率Fig.9 Viability of BEL 7402 cells after incubation with different concentrations of N，P-CDs for 24 h

3.9 細胞成像

如圖10 所示，在與N，P-CDs 孵育30 min 后，可以在明場中觀察到梭形細胞。基于上述“激發依賴”行為，細胞在不同的激發下發出藍光、綠光和紅光。疊加圖像顯示，這些FL 發射位于細胞中，表明N，P-CDs 已內化到細胞中。隨后，細胞用Hg2＋(125 μmol/L)處理，FL 在短時間內(10 min)猝滅。與外源性Cys(150 μmol/L)再孵育30 min 后，FL 再次恢復。這些結果證實N，P-CDs 能夠感知活細胞中的Cys。

圖10 (a)～(e)N，P-CDs 處理的BEL 7402 細胞的共聚焦熒光圖像；BEL 7402 細胞與N，P-CDs 和Hg2＋(125 μmol/L，(f)～(j))一起孵育、細胞與N，P-CDs/Hg2＋和Cys 一起孵育((k)～(o))的共聚焦熒光圖像。Fig.10 Confocal fluorescence images of N，P-CDs-treated BEL 7402 cells((a)－(e))，BEL 7402 cells incubated with N，PCDs and Hg2＋(125 μmol/L，(f)－(j))，cells incubated with N，P-CDs/Hg2＋and Cys((k)－(o)).

4 結 論

本文以葉酸和N-(膦酰基甲基)亞氨基二乙酸為前驅體，成功制備了一種具有豐富氮含量(10.0%)和適當磷摻雜的新型N，P-CDs。N，PCDs 對Hg2＋表現出熒光猝滅，可能是由于N，PCDs 和Hg2＋之間的電子轉移。更重要的是，基于N，P-CDs/Hg2＋的猝滅熒光，構建了Cys/Hcy 增強型納米探針。利用Hg-SH 更強的親和力來實現對Cys/Hcy 的靈敏測定，檢測限低至30 nmol/L，優于目前大多數用于Cys 分析的FL 探針。對于自來水和尿液等真實樣品檢測也獲得了滿意的實驗結果，證明樣品抗基質干擾能力強。通過細胞成像實驗也證實了N，P-CDs 能夠感知活細胞內的Cys。本文所制備的N，P-CDs 因其超低的細胞毒性和出色的細胞滲透性，使得該探針在生物傳感和其他分析領域具有巨大的應用潛力。本文專家審稿意見及作者回復內容的下載地址:http://cjl.lightpublishing.cn/thesisDetails＃10.37188/CJL.20210389.