經耳迷走神經刺激對急性創傷性顱腦損傷大鼠神經功能的改善作用及其機制

鄭粲，王革生，王文鑫，王清華

1 北京中醫藥大學東方醫院，北京100078；2 北京中醫藥大學東方醫院神經外科

顱腦損傷是發生率僅次于四肢傷的常見創傷性疾病，發病率占全身各部位創傷的9%～21%，其致殘、致死率高［1］。繼發性顱腦損傷是患者致死、致殘的主要原因，主要由于腦水腫逐漸加重，伴隨顱內壓升高、腦灌注減少，導致腦組織缺血和神經功能障礙。現階段對顱腦損傷仍缺乏有效的治療手段［2-3］。迷走神經刺激術（VNS）于上世紀九十年代中期開始用于治療頑固性癲癇［4］，效果確切，不良反應較少且容易耐受。最近也有報道VNS 可用于顱腦損傷［5］、抑郁癥［6］、頭痛［7］、阿爾茨海默病［8］、腦卒中［9］、炎癥［10］等疾病的治療。雖然其作用機制尚不完全清楚，但有效性和安全性得到初步證實。根據VNS 及中醫針灸理論，有學者提出用經皮電刺激耳部迷走神經分布區的方法即經耳迷走神經刺激術（t-VNS）治療部分發作性癲癇［11］。該方法在保留VNS 有效性的基礎上，避免有創性手術，而且不良反應少，治療費用低。一項前瞻性臨床研究證實，無創t-VNS 是安全且能夠長期耐受的，可以作為癲癇患者的治療選擇［12］。YLIKOSKI等［13］和TU等［14］也分別證實了t-VNS對耳鳴和抑郁癥有治療作用。基于上述研究，2020年7月—2021年6月，本研究觀察了t-VNS對急性創傷性顱腦損傷大鼠的神經保護作用，并初步探討其機制，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 清潔級3 月齡SD 雄性大鼠36 只，體質量（280 ± 20）g，由軍事醫學科學院實驗動物中心提供，許可證號SCXK-（軍）2012-0045。戊巴比妥鈉購自北京冬歌生物公司。多聚甲醛購自北京尚柏生物公司。DAB濃縮顯色劑、SABC試劑盒購自武漢博士德公司。兔抗大鼠腫瘤壞死因子α（TNF-α）單克隆抗體（一抗）、兔抗大鼠水通道蛋白4（AQP4）單克隆抗體（一抗）、兔抗大鼠巨噬細胞α7 煙堿型乙酰膽堿受體（α7nAChR）單克隆抗體（一抗）購自美國Sigma 公司。即用型快速免疫組化Max VisionTM試劑盒（二抗）、PBS 粉購自北京尚柏生物公司。實驗用手術顯微鏡購自德國Carl Zeiss 公司。大鼠用恒溫毯購自Gene&I 公司。Viking-Ⅳ型監測儀購自美國Nicolet 公司。牙科鉆購自山東新華醫療設備廠。石蠟切片機購自德國Leica 公司。光學顯微鏡（BX400）購自日本Olympus 公司。自由落體腦損傷模型打擊器（ZH-ZYQ 型）購自淮北正華生物儀器設備有限公司。自制耳夾式刺激電極。

1.2 動物分組、模型制備及治療方法 實驗動物按體質量大小編號，隨機分成假手術組、模型組、治療組，各12只。模型組和治療組采用改良Feeney法制備急性創傷性顱腦損傷模型［15-17］：大鼠經1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射麻醉，頭部固定于腦立體定向儀、消毒，沿中線切開頭皮，分離至骨膜下顯露顱骨，以冠狀縫后4 mm、中線旁開3 mm 為中心磨開4 mm×4 mm 的骨窗（右側）；40 g 砝碼自25 cm 高度沿垂直導管自由下落，撞擊撞針造成顱腦創傷；傷口滴注硫酸慶大霉素預防感染，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮，充足水和食物喂養。以改良神經功能缺損評分（mNSS）為13 ～18 分判定為模型制備成功。假手術組僅切開頭皮打開骨窗，不實施撞擊。治療組造模成功30 min 后給予t-VNS，用自制的耳夾電極夾于右側耳甲腔迷走神經分布區，導線連接于Viking-Ⅳ型監測儀，刺激強度1 mA、間期0.5 ms、頻率20 Hz，在1 h 內每隔5 min 刺激1 次，每次持續30 s，連續刺激3 d。模型組及假手術組不給予刺激。

1.3 神經功能評價 造模72 h 后采用mNSS 評價大鼠神經功能［15-16，18］。

1.4 腦含水量測算 神經功能評價后，以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉處死大鼠，取出大腦，去除小腦、視神經、左側大腦半球等，以損傷灶為中心冠狀切開右側大腦半球，取額側一半組織測算腦含水量。濾紙吸盡表面血漬，置于烤干并稱重的錫紙上，電子天平稱腦組織濕重，然后放入95 ℃恒溫箱烘烤24 h后稱干重，根據公式計算腦含水量。腦含水量=（腦濕重－腦干重）/腦濕重×100%。

1.5 腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR檢測

1.5.1 Western blotting 法檢測 取枕側一半損傷灶處腦組織1 塊，質量約100 mg，加入4 ℃預冷組織裂解液2 mL，勻漿，4 ℃下12 000 r/min 離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍G250結合法檢測總蛋白濃度。進行SDS-PAGE 蛋白電泳，將目的蛋白凝膠轉移至PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；分別與兔抗大鼠AQP4、TNF-α、α7nAChR 一抗（1∶2 000）和兔抗大鼠β-actin一抗（1∶2 000）反應，4 ℃孵育過夜；與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG二抗（1∶1 000）室溫孵育2 h；暗室內進行ECL 反應，X 線膠片顯影、定影，凝膠成像分析系統采集并分析條帶灰度值作為目的蛋白相對表達量。

1.5.2 免疫組化法檢測 溫生理鹽水及4%多聚甲醛灌注取腦，取損傷灶處腦組織100 mg，4%多聚甲醛固定，經梯度乙醇脫水、二甲苯透明后，常規石蠟包理、切片。切片常規脫蠟至水，滴加3%H2O2孵育15 min，檸檬酸緩沖液微波法修復抗原20 min，自然冷卻至室溫，山羊血清室溫封閉30 min；分別滴入一抗兔抗鼠AQP4、TNF-α、α7nAChR 抗體（1∶400），4 ℃孵育24 h；滴加二抗（山羊抗兔）室溫反應30 min；滴加辣根過氧化物酶標記的卵白素工作液，室溫反應15 min；DAB 顯色劑呈色，梯度脫水、中性樹脂封片。光鏡下觀察，細胞質有棕黃色顆粒者為陽性細胞。采用Image-Pro Plus6 軟件分析平均光密度值作為蛋白相對表達量。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0 統計軟件。對計量資料進行正態性檢驗，符合正態分布的數據以±s表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠mNSS 比較 造模72 h 后假手術組、模型組、治療組mNSS 分別為0、（11.50 ± 1.73）、（8.33±2.42）分，模型組mNSS 高于假手術組，治療組低于模型組（P均＜0.05）。

2.2 各組大鼠腦含水量比較 假手術組、模型組、治療組腦含水量分別為76.05% ± 0.79%、81.65% ± 1.30%、79.15% ± 1.15%，模型組腦含水量高于假手術組，治療組低于模型組（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR 表達比較 模型組AQP4、TNF-α蛋白表達高于假手術組（P均＜0.05）；治療組AQP4、TNF-α 蛋白表達低于模型組，α7nAChR 蛋白表達高于模型組（P均＜0.05）。Western blotting 法檢測結果見表1，免疫組化法檢測結果見表2、圖1。

圖1 三組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白表達情況（免疫組化法）

表1 三組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋Western blotting法檢測結果比較（±s）

表1 三組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋Western blotting法檢測結果比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別治療組模型組假手術組n 12 12 12 AQP4 0.54±0.06*0.76±0.05 0.13±0.03*TNF-α 0.49±0.06*0.87±0.06 0.18±0.04*α7nAChR 0.70±0.11*0.23±0.05 0.21±0.05

表2 三組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白免疫組化法檢測結果比較（±s）

表2 三組大鼠腦組織中AQP4、TNF-α、α7nAChR蛋白免疫組化法檢測結果比較（±s）

注：與模型組相比，*P＜0.05。

組別治療組模型組假手術組n 12 12 12 AQP4 0.34±0.08*0.57±0.10 0.09±0.06*TNF-α 0.54±0.11*0.92±0.05 0.21±0.07*α7nAChR 0.63±0.10*0.19±0.07 0.16±0.08

3 討論

外耳由3 種感覺神經支配，其中迷走神經耳支（Arnold 神經）是迷走神經在體表的惟一分支，分布于外耳廓耳甲腔、耳輪腳根部、耳甲艇，是迷走神經、面神經和舌咽神經的混合支。多項研究證實，電刺激耳 屏 內側面相當于VNS［19-21］。BADRAN 等［22］和KRAUS 等［23］也發現，電刺激健康志愿者的左側耳屏內側面，杏仁核、海馬、海馬旁回等邊緣系統的BOLD 信號下降，而島葉、丘腦、中央前回的活動增強，這與VNS 所得結果一致［24-26］。因此，在臨床治療中，t-VNS具有替代甚至取代VNS的可能。

創傷性顱腦損傷是神經外科最常見的疾病之一，起病急驟，有很高的病死率及致殘率，其有效救治及神經功能修復是臨床難題。為了提高救治及修復效果，臨床實踐中嘗試運用各種藥物及方法進行治療，但總體效果不佳。近年來，大量動物研究及臨床研究證實，VNS 能夠有效減輕創傷后繼發性顱腦損傷，提高患者康復率及生存率［27］。VNS 主要是通過抑制氧化應激、炎癥反應和減少細胞凋亡來減輕創傷后腦損傷［28］。

創傷性顱腦損傷后繼發腦水腫是常見的病理生理表現，也是嚴重的并發癥，能夠引起顱內壓升高甚至腦疝等。能否減輕腦水腫是臨床救治創傷性顱腦損傷的關鍵環節。AQPs是一種質膜通道，能夠促進水分子雙向跨膜運輸，與顱腦損傷后腦水腫發生密切相關。AQP4 是AQPs 家族重要成員之一，在哺乳動物腦組織中含量最豐富［29］。KITCHEN 等［30］發現，創傷性顱腦損傷后AQP4 表達顯著增加，通過靶向抑制AQP4 表達可以明顯減輕腦水腫。LOPEZ 等［31］研究顯示，VNS 治療組與假手術組大腦AQP4 表達水平相似，即VNS 可以調節大腦組織AQP4 表達，進一步減輕腦水腫。

炎癥反應在創傷性顱腦損傷的病理生理機制中具有重要作用。顱腦損傷后產生一系列炎癥反應，腦組織中大量炎癥細胞聚集，促進炎癥因子的釋放，進一步加重腦損傷［32］。迷走神經能夠很好地介導中樞神經系統與免疫系統之間的信息傳導。VNS 可以通過多種途徑及通路發揮抑制炎癥的效應，從而起到保護腦組織、治療類風濕關節炎等作用［33］。MASHIMO 等［34］研究表明，α7nAChR 作為炎癥反應的效應器，其激活可以抑制相關炎癥因子分泌，在調控炎癥因子產生的過程當中發揮著關鍵作用。VNS后，乙酰膽堿在神經末梢釋放，與免疫細胞上的α 7nAChR結合，通過細胞內信號轉導途徑阻止炎癥因子TNF-α、IL-6 等的釋放，對炎癥反應進行調節［33，35］。

本研究結果顯示，治療組mNSS、腦含水量及腦組織中AQP4 表達低于模型組，提示治療組的腦水腫程度較模型組輕，神經功能恢復程度更好，其機制可能是t-VNS 能夠降低AQP4 的表達，減輕腦水腫，從而改善預后。同時，治療組腦組織中TNF-α 表達低于模型組、α7nAChR 表達高于模型組，提示t-VNS可能通過上調α7nAChR 表達、抑制TNF-α 等炎癥因子釋放，從而減輕創傷性顱腦損傷的腦組織炎癥反應。結合本研究的各項結果，我們認為，在創傷性顱腦損傷的治療中，t-VNS 可能具有和VNS 相近的效果和作用機制。近年來，t-VNS 被用于多個學科的基礎及臨床研究中，如自主神經功能、疼痛、炎癥、心血管系統、心理及認知功能、消化系統等［36］，t-VNS通過利用機體自身保護機制，針對癥狀產生的根本因素進行調節從而減輕癥狀，是一種值得深入探索和研究的新型治療方式。

綜上所述，t-VNS 對急性創傷性顱腦損傷大鼠具有神經保護作用，其機制可能與下調AQP4 表達、上調α7nAChR表達、減輕炎癥反應有關。