組蛋白修飾對神經(jīng)發(fā)育影響及與神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病發(fā)病的關系

張驕，鐘敏

重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院康復科國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室兒科學重慶市重點實驗室，重慶400014

兒童神經(jīng)發(fā)育障礙（NDDs）是一組以認知、交流、行為或運動技能障礙為主要特征的疾病，具有高度的表型和遺傳異質(zhì)性。NDDs 包括語言障礙、智力障礙/全面性發(fā)育遲緩、癲癇、注意力缺陷多動障礙和孤獨癥譜系疾病等［1］。它們常不單獨出現(xiàn)，往往伴隨或合并其他功能障礙。NDDs 致病機制復雜，包括多種遺傳性因素和環(huán)境危險因素等。表觀遺傳學包含染色體重塑、DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA 等方式。組蛋白修飾是表觀遺傳學中重要的修飾方式之一，包括組蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化等。組蛋白修飾參與DNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、修復、復制、基因沉默及細胞分化等過程［2］，在神經(jīng)發(fā)育中起著重要的調(diào)節(jié)作用，其水平異常可影響正常信號通路而致病。隨著分子診斷技術的廣泛應用，許多基因被發(fā)現(xiàn)，迄今為止確定編碼蛋白的基因在某些保守途徑發(fā)揮作用，如蛋白合成、修飾、突觸信號或表觀遺傳調(diào)節(jié)等。其中編碼組蛋白乙酰化或組蛋白甲基化相關蛋白的基因有CREBBP、EP300、KAT6A、KMT2D 等。現(xiàn)就組蛋白修飾對神經(jīng)發(fā)育的影響及與NDDs發(fā)病的關系相關研究進行綜述。

1 組蛋白修飾對神經(jīng)發(fā)育的影響

組蛋白作為染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)蛋白，由H2A、H2B、H3、H4構(gòu)成八聚體，周圍纏繞著大約147 bp的DNA，連接組蛋白H1 鎖定核小體兩端的DNA。組蛋白翻譯后修飾是基因表達的重要調(diào)節(jié)機制，這些修飾主要發(fā)生在組蛋白的N 端，通過一系列特定的酶或結(jié)合蛋白作為“書寫器”“擦除器”“閱讀器”來產(chǎn)生、消除或識別這些翻譯后修飾，以精確調(diào)控“組蛋白密碼”［3］。特定的修飾狀態(tài)可影響組蛋白與DNA結(jié)合的親和力，改變?nèi)旧w構(gòu)象或招募特定蛋白質(zhì)影響基因活性，進而影響大腦發(fā)育、神經(jīng)元分化及認知行為表型等［4］。組蛋白乙酰化及甲基化是最常見的兩種修飾。

1.1 組蛋白乙酰化異常影響神經(jīng)發(fā)育 組蛋白乙酰化是引起染色質(zhì)結(jié)構(gòu)改變、基因表觀轉(zhuǎn)錄調(diào)控的的重要機制。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HATs）與組蛋白去乙酰化酶（HDACs）共同調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化修飾水平。組蛋白乙酰化可促進轉(zhuǎn)錄因子招募到暴露的DNA，而去乙酰化則抑制轉(zhuǎn)錄活性，限制轉(zhuǎn)錄因子的獲取，二者的平衡決定了多數(shù)動態(tài)表達基因的轉(zhuǎn)錄可及性和活性［5］。

HATs 根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域的不同，主要分為GNAT超家族、P300/CBP 家族、MYST 家族（包括Moz、Ybf2/Sas3、Sas2、Tip60 四個成員）三類［6］。HATs 異常與神經(jīng)退行疾病的發(fā)生密切相關。MYST 家族中的Tip60 可控制神經(jīng)元特異性基因表達，是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育與功能所必須的。Tip60 缺陷與突觸囊泡擴張、神經(jīng)傳遞缺陷、突觸微管重排等有關。Tip60 對突觸可塑性有促進作用，對學習與記憶功能起著重要作用［7］。另外，具有HATs活性的CBP在腦體積調(diào)節(jié)、神經(jīng)細胞分化和神經(jīng)前體細胞遷移中起著核心作用［8］。缺乏乙酰化活性的CBP 突變小鼠會出現(xiàn)長期記憶受損，而去乙酰化酶抑制劑可以增強長期記憶、提高突觸可塑性，給予去乙酰化酶抑制劑可改善CBP突變小鼠的長期記憶［9］。

已報道的HDACs 有18 種，根據(jù)氨基酸序列可分為四大類（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類蛋白），這些酶通過鋅依賴或NAD+依賴機制去乙酰化。HDACs 在不同的發(fā)育階段及不同類型細胞之間有表達差異，通過影響組蛋白乙酰化水平來調(diào)控神經(jīng)細胞增殖、分化、調(diào)亡、遷移及突觸再生等，進而影響神經(jīng)發(fā)育。產(chǎn)前HDAC1 或HDAC2 基因純合缺失小鼠的大腦發(fā)育、腦結(jié)構(gòu)及壽命無明顯變化，而HDAC1、HDAC2 基因產(chǎn)前同時純合缺失會導致大腦發(fā)育異常、胚胎死亡。研究顯示，HDAC1、HDAC2 基因共同缺失可導致DNA 損傷、細胞增殖受阻、細胞調(diào)亡增多、神經(jīng)中間祖細胞于異常區(qū)域增殖分化，造成大腦皮層畸形等［10-11］。此外，HDAC1、HDAC2 基因產(chǎn)前共同缺失可導致自發(fā)性小膠質(zhì)細胞損傷，而對于成年人小膠質(zhì)細胞，HDAC1、HDAC2 基因缺失沒有出現(xiàn)細胞自發(fā)激活或凋亡的現(xiàn)象。HDAC1、HDAC2基因缺失會增強小膠質(zhì)細胞淀粉樣蛋白的吞噬，從而減少斑塊負荷，防止認知能力下降［12］。

1.2 組蛋白甲基化影響神經(jīng)發(fā)育 組蛋白甲基化是一種重要的組蛋白修飾，與組蛋白乙酰化修飾相似，組蛋白甲基化修飾由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和組蛋白脫甲基化酶調(diào)控。但與組蛋白乙酰化生物效應不同，甲基化后激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄的效應決于甲基化的位點、程度、模式及其發(fā)生的基因組環(huán)境。組蛋白甲基化主要通過影響RNA 聚合酶Ⅱ與基因結(jié)合或與DNA 甲基化、組蛋白乙酰化等多種表觀遺傳修飾相互作用來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄。有實驗表明，作為組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶中的核受體結(jié)合SET 結(jié)構(gòu)域（NSD）蛋白家族成員之一NSD2，在小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的增殖階段其表達水平迅速升高，而在分化階段其表達水平下降，提示NSD2 可能具有促進細胞增殖、抑制細胞分化的功能［13］。LSD1是最先發(fā)現(xiàn)的組蛋白賴氨酸脫甲基酶（KDM），其催化H3K4me1/2、H3K9me1/2 脫甲基化。LSD1 敲除的小鼠可在胚胎時期死亡。CHRISTOPHER 等［14］選擇性敲除成年小鼠的LSD1 基因，小鼠大腦中LSD1 的缺失導致皮層和海馬體中廣泛的神經(jīng)元死亡。KDM6B 是另一種組蛋白脫甲基化酶，據(jù)報道，其在有絲分裂后的神經(jīng)元中發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)突觸功能。上述研究提示，組蛋白甲基化修飾在神經(jīng)發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。

2 組蛋白修飾異常與NDDs發(fā)病的關系

2.1 組蛋白乙酰化酶相關基因異常導致疾病

2.1.1 Rubinstein-Taybi 綜合征（RTS） RTS 是一類以拇指/大趾粗大、幻覺、生長發(fā)育遲緩、智力障礙、特殊面容（如特征性“鬼笑臉”）和身材矮小為主要特征的罕見的常染色體顯性遺傳病。據(jù)文獻報道，CREBBP、EP300基因突變與該疾病相關，它們分別編碼cAMP 調(diào)節(jié)的增強子結(jié)合蛋白和E1A 結(jié)合蛋白，均含有HATs 活性。CREBBP、EP300 基因功能有一定重疊，但不能相互替代。由CREBBP 基因突變所致RTS 占50% ～70%，而EP300 基因突變所致的RTS較罕見。兩種基因突變通過單倍體劑量不足或顯性抑制效應［15］等機制影響組蛋白乙酰化。另外，有40%的RTS患者致病機制尚不明確。

果蠅中P300/CBP 家族的同源基因為nejire，在調(diào)控組蛋白乙酰化、調(diào)節(jié)突觸發(fā)育和功能方面發(fā)揮重要作用。CREBBP、EP300基因純合突變可致小鼠胚胎死亡；CREBBP、EP300 基因均雜合突變的小鼠也無法生存［16］；CREBBP、EP300 基因單雜合突變所致表型與RTS患者表型相似。在CREBBP 基因雜合突變小鼠中檢測到組蛋白H2B 乙酰化水平降低，而EP300雜合突變小鼠乙酰化水平無明顯改變。

2.1.2 KAT6A 綜合征、Genitopatellar 綜合征及SBBYSS 綜合征 KAT6A 綜合征是一種由染色體8p11上編碼賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的KAT6A 基因突變所致的常染色體顯性遺傳病。KAT6A 基因包含18 個外顯子，該基因編碼的KAT6A 屬于MYSY 家族的賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶，可乙酰化組蛋白H3K9、K18、K23。KAT6A 基因突變可引起與神經(jīng)及發(fā)育相關的罕見綜合征，主要表現(xiàn)為肌張力低下、全面發(fā)育遲緩、喂養(yǎng)困難、小頭畸形、心血管畸形、特殊面容（如鼻頭寬、低耳位、薄上唇、寬額頭、雙側(cè)顳骨窄）等。近端外顯子1-15 突變的患者臨床表現(xiàn)比遠端外顯子突變患者更輕。有學者推測近端外顯子突變是由于蛋白質(zhì)功能不足導致，而遠端外顯子突變可能是一種功能獲得性突變或由顯性抑制效應所致［17］。

位于染色體10q22.2 的KAT6B 基因所編碼的HATs也屬于MYSY 蛋白家族，該蛋白參與正反轉(zhuǎn)錄調(diào)控。KAT6B 突變導致KAT6B 基因相關疾病，如Genitopatellar 綜合征（又稱生殖器—髕骨綜合征）和SBBYSS 綜合征。這兩種綜合征有許多相似的臨床表型，如智力障礙或全面發(fā)育遲緩、先天性心臟缺陷、骨骼發(fā)育不全和男性生殖器異常、牙齒和甲狀腺異常、聽力下降等。髖膝關節(jié)屈曲痙攣、足畸形、腎積水或腎囊腫、胼胝體發(fā)育不全為Genitopatellar 綜合征的特有表型。面具臉、淚管異常和眼瞼下垂、長拇趾僅存在于SBBYSS綜合征［18-20］。因Genitopatellar綜合征和SBBYSS 綜合征臨床表型相似、易于混淆，有學者提出了“KAT6B 譜系障礙”概念，多通過突變位置加以鑒別。根據(jù)基因型—表型可將KAT6B 突變分為4 組：第1 組突變（外顯子15-16 及外顯子17近端）與SBBYSS 相關；第2 組突變（外顯子17 遠端及外顯子18 近端）與Genitopatellar 綜合征相關；第3組突變（外顯子18 內(nèi)部，p.1350-p.1520）大多具有Genitopatellar/SBBYSS 混合表型；第4 組突變（外顯子18遠端）與SBBYSS相關［5，21］。

果蠅中可以找到與KAT6A、KAT6B 同源基因Enok，是影響神經(jīng)母細胞增殖的關鍵因素。神經(jīng)母細胞Enok 基因表達缺失導致HATs 活性異常，影響果蠅嗅覺及求偶記憶中心蘑菇體的發(fā)育［22］。KAT6A 基因敲除小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性。KAT6A純合缺失的小鼠出現(xiàn)顱面部發(fā)育異常、心臟缺陷，這與KAT6A 基因在顱面部發(fā)育過程中調(diào)控HOX 基因表達［23］、在心臟發(fā)育過程中抑制Tbx1基因和Tbx5基因表達［24］有關。而KAT6B 基因表達異常相關動物模型較少，KAT6B 異常小鼠表現(xiàn)為發(fā)育不良、顱面異常、體質(zhì)量下降、大腦皮質(zhì)減少等［25］。

2.2 HDACs 相關基因異常導致疾病 2q37 缺失綜合征也稱短指/趾—智力低下綜合征或AHO-like 綜合征，是由于2q37 部分片段缺失所致，缺失片段可含有多個基因，導致臨床表型多樣。研究表明，HDAC4 基因是2q37 缺失綜合征致病的關鍵基因。2q37 缺失綜合征主要表現(xiàn)為智力障礙、發(fā)育落后、自閉癥、顱面部畸形（包括眉弓高突、V 形鼻尖、上唇薄、耳位低、頭發(fā)稀疏等）、E 型短指/趾畸形、身材矮小、肥胖、睡眠障礙等。HDAC4基因定位于2q37.3，編碼HDACs4，為Ⅱ型組蛋白脫乙酰酶。其在大腦神經(jīng)元中廣泛表達。越來越多的證據(jù)表明，HDAC4基因在神經(jīng)功能中發(fā)揮重要作用。果蠅HDAC4 基因表達異常可導致長期記憶受損，可能是突觸可塑性受損及與MEF2 不能正確定位進而影響蘑菇體發(fā)育。MEF2 家族在促進神經(jīng)元存活、調(diào)節(jié)記憶形成及樹突發(fā)生中有重要作用［26］。MEF2A、MEF2C 及MEF2D 在骨骼發(fā)育中不可或缺，與HDAC4 相互作用可影響骨骼及肌肉發(fā)育［27-28］。

2.3 組蛋白甲基化酶相關基因異常導致疾病

2.3.1 歌舞伎綜合征 歌舞伎綜合征是由Niikawa和Kuroki 于1981 年首次報道的一種罕見的累及多系統(tǒng)的先天性疾病。歌舞伎綜合征以特殊面容、骨骼及皮紋異常、智力障礙、發(fā)育遲緩主要臨床特征，其面容表現(xiàn)為眉外側(cè)1/3稀疏或缺失、長臉裂、下眼瞼外側(cè)1/3 外翻、鼻柱短小、鼻尖凹陷、大而突出的耳朵等。歌舞伎綜合征主要是由參與表觀遺傳調(diào)控的KMT2D、KDM6A 基因突變所致，其中由KMT2D突變所致者占50%～80%。因KMT2D 基因、KDM6A基因突變所致的臨床表型存在一定差異，二者突變所致綜合征被分別稱為Kabuki 綜合征1 型、Kabuki綜合征2型，目前沒有特征性表型來區(qū)分它們。

KMT2D 基因位于染色體12q13.12 上，編碼一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，催化組蛋白H3 第4 位氨基酸（H3K4）甲基化。敲除KMT2D 或KMT6A 基因的斑馬魚表現(xiàn)出顱面部缺陷。H3K4 甲基化可調(diào)控與胚胎生長發(fā)育相關的基因轉(zhuǎn)錄。在小鼠模型中，完全敲除KMT2D 基因可致胚胎死亡［29］。KMT2D 雜合突變小鼠的海馬齒狀回顆粒細胞層神經(jīng)生成減少，海馬齒狀回體積減少，這些小鼠在Morris水迷宮、場景恐懼實驗和新物體識別實驗中表現(xiàn)出記憶受損；在細胞分子水平上，此類小鼠顆粒細胞中的H3K4 甲基化水平顯著下降［30］。在果蠅蘑菇體中，同源基因trr被敲除可導致果蠅短期記憶受損。

約5%的歌舞伎綜合征是由于KDM6A 基因突變所致。KDM6A 基因位于Xp11.3，編碼組蛋白脫甲基酶，作用于二甲基化或三甲基化的組蛋白H3第27 位賴氨基酸殘基（H3K27）。現(xiàn)已證實KDM6A 是X 染色體失活逃逸基因，具有性別差異表達［31］。H3K4甲基化伴隨著H3K27去甲基化［32］，故KMT2D、KDM6A 基因突變可致相似的綜合征。KDM6A 的果蠅同源物dUtx 參與多種生物過程，如細胞自噬、Notch 信號通路通路、DNA 損傷反應等［22］。果蠅dUtx 去甲基酶活性在維持正常早期胚胎階段及果蠅成蟲的生存中有著重要作用［33］。

2.3.2 Sotos 綜合征 Sotos 綜合征又稱腦性巨人癥，是一種出生前或出生后過度生長的罕見常染色體顯性遺傳病，表現(xiàn)為體型巨大、出生后生長過快、特殊面容（巨頭畸形、前額突起、下頜尖長、眼距寬等）、骨齡超前及發(fā)育落后等。大部分Sotos 綜合征與NSD1 基因突變或NSD1 基因所在的染色體5q35微缺失有關，不同地區(qū)報道的這兩種病因所占比例有所差異。NSD1 基因編碼可甲基化組蛋白H3K36的甲基轉(zhuǎn)移酶，其發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄或抑制轉(zhuǎn)錄作用取決于細胞所在環(huán)境［22］。NSD1 基因在人類和小鼠中高度保守。完全敲除NSD1 基因的小鼠胚胎無法存活，與野生小鼠相比，腦部體積縮小。但有報道稱，NSD1基因雜合突變小鼠與純合突變小鼠表型不同，雜合突變的小鼠未發(fā)生前腦體積減少，沒有觀察到皮質(zhì)形態(tài)學異常，過度生長不明顯并具有生存和生育能力［34-35］。果蠅中只有一種同源NSD 蛋白，Sotos綜合征果蠅模型實驗表明，NSD 純合缺失導致的發(fā)育異常與人Sotos 綜合征患者相似［36］。APC2 基因表達異常也可導致Sotos 綜合征。NSD1 與APC2 相互作用使得皮層祖細胞正常遷移，NSD1 敲除可抑制APC2 表達，導致大量神經(jīng)元留在皮層下。APC2 可能是NSD1 控制的關鍵下游基因，若兩者相互關系被破壞，均可能導致Sotos綜合征［37］。

2.3.3 Wiedemann-Steiner 綜 合 征 Wiedemann-Steiner綜合征是由KMT2A 基因突變引起的，主要表現(xiàn)為智力低下、特殊面容（面部圓扁、鼻子扁平、瞼裂窄、短耳）、小頭畸形、身材矮小、多毛及自閉癥，是一種極其罕見的常染色體顯性遺傳的神經(jīng)發(fā)育疾病。KMT2A 基因位于染色體11q23，編碼可特異性甲基化H3K4 的組蛋白賴氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在發(fā)育早期和造血功能中發(fā)揮重要作用。H3K4 特異性甲基轉(zhuǎn)移酶KMT2A對海馬突觸可塑性至關重要，可能與認知功能障礙有關［38］。KMT2A 雜合突變的小鼠表現(xiàn)出長期恐怖記憶損害，KMT2A 基因敲除的小鼠海馬神經(jīng)元中H3K4 甲基化水平降低，與神經(jīng)變性和記憶障礙模型小鼠中觀察到的變化存在重疊［39］。由此可知，KMT2A 基因與神經(jīng)發(fā)育及退行性病變的發(fā)生有關。

隨著分子診斷技術的不斷進步，表觀遺傳學與人類疾病有關的證據(jù)越來越多，學者們對表觀遺傳學疾病有了新的認識。組蛋白的表觀遺傳修飾與神經(jīng)發(fā)育有密切關系。本研究描述了其中幾種罕見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病。除此之外，HDAC6、KDM5C、EZH2、PRMT7 等組蛋白修飾相關基因異常也可導致不同的NDDs。由上述研究可知，參與組蛋白乙酰化或甲基化過程的酶完全缺乏常常導致胚胎死亡；通過單倍劑量不足機制致病的雜合突變可影響其編碼產(chǎn)物參與生理過程穩(wěn)態(tài)，導致兒童早期發(fā)病。無論是通過組蛋白甲基化還是乙酰化，都可影響單個基因或多個基因的調(diào)控，異常的調(diào)控導致信號通路異常，影響多種酶的功能，可導致多系統(tǒng)發(fā)育異常，故不同基因異常可能造成相同或相似的臨床表現(xiàn)。另外，多種組蛋白表觀修飾酶可調(diào)節(jié)其他非組蛋白系統(tǒng)。有證據(jù)表明，異常的組蛋白修飾在腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移與組蛋白表觀修飾平衡失調(diào)密切相關。目前一些HDACs 及去甲基化酶抑制劑在抗腫瘤研究中取進展，如果它們通過臨床試驗，可能成為治療NDDs 的有力候選藥物。目前對組蛋白修飾與神經(jīng)發(fā)育之間的相互作用機制知之甚少，進一步研究相關機制，可為神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病的治療提供新的理論依據(jù)并為藥物研究、開發(fā)提供新的思路。