高原環境因素致男性生殖系統氧化應激損傷的機制研究進展

馬剛，張凱，常德輝，張斌

1 甘肅中醫藥大學第一臨床醫學院，蘭州730000；2 中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院泌尿外科

高原是指具有寒冷干燥、低大氣壓、低氧分壓、高太陽輻射等氣候特點，海拔位于500 m 以上的地區。研究高原環境因素對人體健康的影響，對于保護高原人群身體健康、促進高原地區順利發展具有重要意義。高原相關生殖損傷近年來成為學界關注的熱點。常德輝等［1］通過實驗模擬海拔4 000 m 成功建立高原大鼠生殖系統損傷模型，并且發現，隨著海拔高度升高，大鼠生殖功能改變越明顯。鄧琛耀等［2］分析國內外文獻，認為高原低氧環境對男性精液質量影響的機制之一是活性氧（ROS）生成過多。過多的ROS 會損害精子DNA，破壞精子細胞膜結構，加速生精細胞和精子凋亡等。但目前國內外關于高原環境因素對男性生殖系統氧化應激（OS）損傷的研究多數集中于生殖內分泌、生殖系統組織生化代謝和精液參數等現象探討方面，針對生殖腺組織細胞超微結構和生精細胞、精子損傷及其調控機制的研究比較缺乏，相應抗氧化治療和預防措施的研究也很少見。現就高原環境因素致男性生殖系統OS損傷的機制相關研究作一綜述。

1 生殖內分泌功能OS損傷及機制

睪丸Leydig細胞合成的睪酮對精子的產生至關重要，睪酮濃度高低對精子的質量和數量影響非常大，睪酮濃度降低會導致無精子癥、少弱精子癥和精子無力癥等。而OS對男性性激素如睪酮、雌二醇等的影響主要為抑制作用。OS 反應會損傷Leydig 細胞的線粒體和內質網，誘發細胞凋亡，導致睪酮合成減少。同時睪酮濃度降低會引起線粒體結構和功能異常，Leydig 細胞凋亡增加，形成惡性循環。此外，ROS還會干擾丘腦—垂體—睪丸軸的反饋調節及下丘腦—垂體—性腺軸與其他下丘腦—激素軸之間的相互作用，導致調節男性生殖功能的激素平衡被打破。有研究表明，與平原地區成年男性比較，高原低氧環境中男性體內雌二醇、睪酮水平明顯降低，糖蛋白激素抑制素B9 水平明顯升高［3］。顧本宏等［4］發現，黃體生成素減少與高原低氧環境暴露時間長短呈正相關，暴露時間越長，黃體生成素生成抑制越明顯。同時，LIAO 等［5］發現，高原環境下，血清睪酮水平與低氧誘導因子1（HIF-1）表達呈負相關，認為低氧環境下生精細胞凋亡與血清卵泡刺激素和睪酮含量的減少有重要關系。孔飛燕等［6］通過實驗表明，左卡尼汀有助于提高高原低氧組大鼠精子質量，維持睪酮、黃體生成素及卵泡刺激素水平。最近，LIU等［7］研究表明，低壓低氧可誘導成年雄性大鼠睪丸瘦素—瘦素受體的表達，提示瘦素—瘦素受體信號可能介導了低氧對雄性大鼠生殖系統的損傷。

2 生殖腺組織細胞結構OS損傷及機制

在高原環境中睪丸組織會產生大量ROS 發生蓄積，抗氧化物質被大量消耗，丙二醛、過氧化氫等含量升高而超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽等水平降低，細胞毒性增加，引起生精上皮細胞脫落，曲細精管管壁變薄，生精細胞和Leydig細胞凋亡增加，睪酮合成和分泌減少，影響精子發生及生殖生理過程。附睪組織中OS會破壞精子成熟，引起附睪指數下降及形態萎縮，顯微結構發生明顯破壞。FARIAS等［8］為研究持續性慢性低壓缺氧和間歇性慢性低壓缺氧對雄性大鼠睪丸組織結構及生化代謝的影響，將雄性大鼠暴露在模擬海拔高度4 600 m（PO289.6 mmHg）60 d，發現持續性慢性低壓缺氧和間歇性慢性低壓缺氧的雄性大鼠在生精周期各階段都會引起睪丸形態明顯變化，如曲細精管管壁變薄、間隙增大，生精上皮細胞空泡化，基底膜折疊和生精細胞凋亡。MADRID 等［9］發現，缺氧最重要的早期變化是睪丸水腫，血漿和睪丸睪酮水平升高，常壓缺氧與高原低壓缺氧產生的效果相似。同時，常德輝等［10］電鏡下觀察高原低氧組大鼠睪丸組織，發現睪丸超微結構受損顯著，而左卡尼汀可提高大鼠的抗氧化能力，減輕低氧對睪丸組織的損傷。

3 精液精子OS損傷及機制

高原低壓低氧環境對精液精子的影響一直是高原生殖損傷研究的焦點。顧本宏等［11］對1 563 例高原地區藏民和藏區漢族移民進行常規精液分析和精子DNA 斷裂指數檢測，發現在高原低氧環境的適應過程中，藏區漢族移民精子濃度和活力發生適應性變化，無精子癥和嚴重少精子癥的發病率均低于本地藏族男性。ZHENG 等［12］研究表明，在3 600 m 海拔高度短期暴露1個月會增加精子畸形的分布。并且，AL-HASHEM 等［13］發現在低壓低氧條件下生活可下調干細胞因子表達、降低精子數和血清生殖激素水平，并顯著增強睪丸組織OS 和脂質過氧化。PELLICCIONE 等［14］研究表明，高海拔地區的體育鍛煉與睪丸功能障礙相關，會導致精子濃度降低，但精子質量健康。動物實驗研究顯示，卵生動物在極端高海拔缺氧條件下孵育幼體，不會阻止卵生外胚層產生可存活的幼體，但可能對卵生后代的發育造成影響［15］。HE等［16］表明，雖然高原缺氧會對精液質量和生殖激素產生不利影響，但這些影響是可逆的。OS可由一系列內源性和外源性因素觸發，高原暴露就是其中之一。ROS是在間歇性慢性低壓缺氧的復氧階段產生的，有助于生理反應的恢復，但當產生的ROS過多，ROS與抗氧化物之間的動態平衡被破壞，則發生OS。OS 會對精子產生諸多不利影響，如脂質過氧化、DNA片段化和凋亡。

3.1 精子脂質過氧化 精子質膜存在豐富的脂質，主要是多不飽和脂肪酸，其亞甲基之間的六個雙鍵是不共軛的。ROS的增加引起精子質膜內多不飽和脂肪酸過氧化，質膜失去了精卵結合所需的膜流動性和完整性，從而導致細胞功能障礙。脂質過氧化除了破壞精子質膜外，其產物還可與電子傳遞鏈上的線粒體蛋白結合并破壞其結構，發生電子泄漏，導致線粒體膜電位降低，ATP 產生減少，精子活力降低［17］。脂質過氧化有三個階段：第一階段是“引發”，即ROS 從多不飽和脂肪酸的碳—碳雙鍵中提取氫原子產生脂肪酸基；第二階段是“擴散”，產生的脂肪酸基與氧快速反應形成過氧脂肪酸基團，當有銅、鐵等金屬離子存在時，過氧脂肪酸基團可再次從多不飽和脂肪酸中提取一個氫原子，產生脂肪酸自由基和脂質過氧化物；第三階段是“終止”，這些形成的脂肪酸自由基彼此反應，生成細胞毒性醛和其他終產物。脂質過氧化的主要產物是4-羥基壬烯醛、丙二醛和丙烯醛，其中丙二醛是分析和監測多不飽和脂肪酸過氧化程度的重要生物標志物。

3.2 精子DNA片段化 研究表明，高原環境因素可改變精子核DNA（nDNA）完整性和線粒體DNA（mtDNA）數目［18］。王瑞等［19］研究發現，長期在高原工作會損傷精子nDNA，精液中ROS過量產生和抗氧化物質水平降低所引起的OS 是導致DNA 片段化的原因之一。OS 可通過激活精子半胱氨酸蛋白酶（Caspase）和核酸內切酶直接或間接損傷精子nDNA 而發生DNA片段化。精子從生精小管通過睪丸網轉移至附睪尾部的過程中暴露于ROS，可使精子發生過程中染色質壓縮錯誤，引起DNA脆弱性增加，導致染色質結構從組蛋白到魚精蛋白的替代失敗，產生8-OH-鳥嘌呤和8-OH-2-脫氧鳥苷（8-OHdG）。8-OHdG 是一種氧化的鳥嘌呤加合物，其水平升高與DNA 片段化和斷鏈顯著相關。王曉蘭等［20］研究發現，精液中ROS和8-OHdG水平與精子運動能力呈負相關，表明精子DNA氧化損傷與精子活力低下有關。目前已知，Sirtuins 蛋白家族中的沉默信息調節因子SIRT1 和SIRT3參與腫瘤遺傳信息傳遞、細胞衰老和OS。NASIRI等［21］通過研究弱精子癥和正常精子男性精液中SIRT1、SIRT3 與抗氧化劑、OS 標志物和DNA 片段化的相關性，發現弱精子組過氧化氫酶、SOD活性和總抗氧化能力水平低于正常精子組，DNA 斷裂指數和丙二醛水平高于正常精子組，弱精子癥組精漿SIRT1、SIRT3 蛋白水平低于正常精子組。這表明SIRT1、SIRT3 蛋白水平與精液中的OS 程度和DNA斷裂水平呈負相關。低水平的SIRT1、SIRT3可能引起OS、DNA片段化和脂質過氧化增強，最終導致精子不活躍和不成熟（弱精子癥）［22］。

在精子mtDNA 數目方面，VENKATESH 等［23］研究發現，在無精子癥、少弱精子癥、精子無力癥和精子數正常性不育的男性精液樣本中均存在mtDNA損傷和數目減少。mtDNA 因缺失DNA 結合蛋白和組蛋白保護以及自身缺乏修復功能，較nDNA 更易受到OS 損傷。mtDNA 損傷會導致部分結構和（或）功能異常的蛋白被編碼產生，進一步促進ROS，形成惡性循環。

DNA 具有雙螺旋結構，DNA 斷裂有單鏈（ss-）和雙鏈（ds-）兩種形式。DNA 修復只能在精子發生的特定階段進行，附睪細胞核凝聚期間，修復機制不再激活。ss-DNA 斷裂修復的下一個機會是人卵母細胞，這是胚胎發育的關鍵一步，但修復DNA 片段化的能力將隨孕婦年齡增加而下降。ds-DNA 斷裂會導致基因組不穩定以及在沒有修復的情況下發生細胞凋亡［24］。據報道，未修復的DNA 片段化超過臨界閾值會對胚胎發育和妊娠結局有不利影響，稱為“父系效應”，含有DNA 片段化的精子在受精后會對囊胚形成、植入和妊娠結局產生負面影響。此外，有學者［25］發現，OS 對卵裂期胚胎發育有不利影響，稱為“早期父系效應”。同時，ZHAO 等［26］通過Meta 分析研究DNA 片段化和輔助生殖技術結局之間的關系，結果表明，DNA 片段化與妊娠結局呈負相關，與流產的發生呈正相關。SMITH 等［27］研究還發現，ROS通過脂質過氧化作用，不僅可引起精子膜流動性發生障礙，還可通過影響精子DNA 功能，使SOD 基因表達減少，減弱機體的抗氧化能力，使過量的ROS不能被有效清除。

3.3 生精細胞和精子細胞凋亡 生精細胞和精子細胞的適度凋亡對于控制精子濃度和保障精子質量至關重要，但過度凋亡則嚴重損害男性生殖健康。以往研究表明，高原低壓低氧環境誘發的OS能顯著增加生精細胞和精子細胞凋亡，其機制是細胞通過多條死亡信號通路和調控途徑進行凋亡，被稱為DNA片段化引起的生理性程序性細胞死亡。

目前認為，有三條通路參與生精細胞和精子細胞凋亡。第一條是線粒體通路，也是體內存在最廣泛的凋亡通路。研究表明，ROS誘導的ds-DNA斷裂可導致細胞凋亡，其機制為ROS破壞線粒體膜，使線粒體膜釋放細胞色素C，激活凋亡相關的Caspase 和膜聯蛋白Ⅴ與磷脂酰絲氨酸結合，產生相應的核酸內切酶損傷精子nDNA，發生DNA 片段化，繼而出現細胞凋亡。因此，精漿中細胞色素C水平過高可能表明過多的ROS對線粒體造成了嚴重的損傷。LU等［28］的實驗表明，線粒體膜電位下降與增加的ROS 直接或間接損傷線粒體膜有關。第二條通路是死亡受體通路。FasL/Fas 死亡受體通路已被證實是OS 損傷導致生精細胞凋亡的途徑之一［29］。當外界有害因素（如缺氧、輻射等）刺激睪丸組織產生大量ROS，ROS作為凋亡啟動劑，引發Fas 與FasL 結合，活化Caspase，進入連續反應階段，最終導致細胞凋亡。最近，YIN 等［30］研究顯示，HIF-1α 基因敲除可減少缺氧誘導的小鼠精母細胞衍生細胞系凋亡，提示HIF-1α 介導的死亡受體通路和線粒體通路可能都參與了缺氧導致的細胞凋亡。學者們還發現，自噬和凋亡在廣泛的串擾中相互關聯，缺氧通過線粒體通路和死亡受體通路誘導細胞凋亡，并以時間依賴性方式抑制細胞自噬。研究表明，缺氧抑制自噬，自噬通過促進Caspase-8 的時間依賴性激活，進一步增強缺氧誘導的小鼠精母細胞凋亡，提示凋亡抑制和自噬激活聯合應用可能是治療缺氧性男性不育的一種策略［31］。同時，YIN 等［32］還發現，生精細胞凋亡和胞質特化破壞可能是缺氧性男性不育的關鍵生物學事件，在生理和（或）病理條件下（如饑餓、缺氧等），自噬在生精細胞或支持細胞中被激活，通過降解細胞骨架組織的負調節因子PDZLIM 結構域1 來抑制生精細胞凋亡、穩定ES的完整性，從而維持生精細胞存活。第三條通路是內質網通路。有學者發現，由內質網功能失常引起的不以細胞膜或線粒體為靶點的凋亡信號觸發即內質網通路，也在細胞凋亡過程中發揮一定作用［33］。OS 會導致內質網功能失調，腔內出現大量未折疊和錯誤折疊蛋白堆積及鈣泵功能紊亂，該狀態被稱為內質網應激（ERS）。崔艷華等［34］研究認為，持續的ERS 會引起睪丸生殖細胞凋亡，ERS 引起的細胞凋亡與Caspase 家族有關。ERS 誘導胞質中的Caspase-7 激活位于內質網膜的Caspase-12，后者可進一步激活Caspase-3，引起細胞凋亡。

高原地區具有獨特的地勢地貌和典型的氣候特點，機體在其低壓、低氧的環境因素刺激下，通過功能狀態的改變，產生不同的效應來適應環境［35］，但同時也會對人體健康產生一些不利影響，如高原低壓低氧環境誘發OS 對男性生殖系統的損害。高原環境對男性生殖系統的影響在生殖內分泌、生殖腺組織細胞結構、生殖系統組織生化代謝以及精液層面有不同的表現。隨著對細胞、基因、分子層面的研究進一步深入，高原環境因素致男性生殖系統OS損傷的分子機制將被進一步解釋，與之對應的預防和診治措施也會進一步完善。