加味當歸芍藥散治療后慢性子宮內膜炎大鼠子宮內膜胞飲突發育及NF-κb、TGF-β1蛋白表達變化

靖文君，蔡平平，王雨琦，李潔穎，李克勤

1 山東中醫藥大學第一臨床醫學院，濟南250014；2 山東第一醫科大學附屬省立醫院中醫科

慢性子宮內膜炎（CE）是降低子宮內膜容受性的關鍵因素之一，常導致反復種植失敗（RIF）［1-2］。目前西醫治療該病大多應用抗生素、宮腔灌注、內膜搔刮等方法，但復發率較高［3］。中醫藥治療CE 具有顯著優勢［4］。多項研究表明，當歸芍藥散在抗炎、改善子宮血流等方面效果顯著［5-7］。李克勤教授為山東省名中醫、第五批全國老中醫藥專家學術繼承指導老師，經過多年實踐經驗，運用加味當歸芍藥散治療RIF合并CE 的患者，療效顯著。2020 年12 月—2021 年8月，本研究采用加味當歸芍藥散治療CE 大鼠，觀察大鼠子宮內膜表面胞飲突的發育情況及大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1蛋白表達變化，初步探討加味當歸芍藥散治療CE的作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

1.1.1 實驗動物 SPF 級實驗SD 雌性大鼠60 只，體質量180～200 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號SCXΚ（京）2016-0011，飼養于山東省立醫院動物房。所有大鼠在實驗室普通清潔環境下飼養，適應性喂養7 d后開始實驗。本實驗經山東省立醫院實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 藥物及試劑 加味當歸芍藥散，由當歸15 g、川芎12 g、赤芍9 g、茯苓15 g、炒白術12 g、丹參6 g、紅花6 g、燀桃仁12 g、黨參15 g、薏苡仁9 g、敗醬草9 g、大血藤9 g、蒲黃9 g、甘草6 g 組成，中藥飲片購自山東第一醫科大學附屬省立醫院中藥房，按照中藥飲片煎煮規范，使用蒸餾水煎煮藥物，最終將中藥液濃縮至分別含生藥2.592、1.296、0.648 g/mL，分裝，4 ℃保存備用。婦科千金膠囊，每粒0.4 g，株洲千金藥業有限公司生產，生產批號Z20020024。GAPDH抗體（稀釋比1∶2 000）、HRP 標記山羊抗兔（稀釋比1∶5 000）、HRP 標記山羊抗鼠（稀釋比1∶5 000）、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、RIPA 裂解液、ECL顯影試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。NF-κB p65 抗 體（稀 釋 比1∶2 000）、TGF-β1抗 體（稀釋比1∶5 000）購自武漢三鷹生物技術有限公司。BAC 蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。25%苯酚凝膠由西黃芪膠1 g、苯酚5 mL、甘油4 mL 加蒸餾水至20 mL 配置。電鏡固定液購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 儀器 PowerPac型電泳儀、轉膜儀購自美國Bio-Rad 公司。ME235S 電子天平購自德國Sartorius公司。Multiskan GO 全波長酶標儀購自美國Thermo Fisher 公司。Vortex3000 渦旋振蕩器、SLΚ-O3000-S搖床購自美國SCILOGEX 公司。GL-150b 干式恒溫器購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司。Fluor Chem R 多功能成像分析系統購自美國Protein Simple 公司。Quorum 臨界點干燥儀（Κ850），HITACHI離子濺射儀（MC1000），HITACHI 掃描電子顯微鏡（SU8100）。

1.2 動物分組、模型制作及給藥方法 將60只大鼠隨機分為空白組、模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、婦科千金膠囊組，每組10 只。空白組正常飼養，模型組、中藥高劑量組、中藥中劑量組、中藥低劑量組、婦科千金膠囊組使用25%苯酚膠漿制備CE 模型［8-9］：大鼠術前禁食不禁水12 h，使用1%戊巴比妥鈉（0.02 g/kg）腹腔注射麻醉大鼠，在大鼠下腹正中行0.8～1.0 cm縱向切口，暴露子宮，用0.25 mL注射器配4號針頭，于子宮分叉處左側朝卵巢方向進針，緩緩推注25%苯酚膠漿0.05 mL［10］，右側子宮不作處理作為自身對照，分層縫合關腹，消毒術區，同時將術后大鼠放入干凈整潔的飼養籠內，保溫至蘇醒狀態。造模1周后，造模各組隨機解剖2只大鼠，肉眼觀察見大鼠左側子宮管壁變薄，管腔內可見大量黃色或清亮液體，管腔呈重度擴張，子宮漿膜面可見充血、腫脹，顏色暗紅，提示造模成功。造模成功當天，按照成人等效劑量折算系數6.3［11］，中藥高、中、低劑量組分別給予25.92、12.96、6.48 g/kg的加味當歸芍藥散灌胃；婦科千金膠囊組給予0.216 g/kg的婦科千金膠囊灌胃；空白組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。各組均按照10 mL/kg 體積給藥，給藥21 d進行后續觀察與檢測。

1.3 大鼠子宮內膜胞飲突觀察方法 末次給藥后24 h，各組大鼠均腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.02 g/kg）麻醉，剪取大鼠左側子宮組織，稱重、切段分裝，取其中一部分子宮組織用PBS充分洗滌后投入電鏡固定液中室溫固定2 h、4 ℃固定3 h，用PBS 漂洗3次、每次10 min，鋨酸室溫避光固定2 h，PBS 再次漂洗3 次、每次10 min，乙醇逐級脫水，于乙酸異戊酯中放置15 min后，放入臨界點干燥儀內干燥，干燥后于離子濺射儀樣品臺上噴金30 s，使用HITACHI 掃描電子顯微鏡觀察胞飲突，并采集圖像。

1.4 大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1蛋白檢測方法 取另一部分大鼠子宮組織在預冷的RIPA 裂解液中進行勻漿處理，收集各組大鼠子宮組織總蛋白，BCA 試劑盒進行蛋白定量。使用8% SDS-PAGE 凝膠進行電泳，將目的蛋白轉移到PVDF 膜上，脫脂奶粉封閉120 min，加入GAPDH、NF-κB、TGF-β1一抗，4 ℃孵育過夜。經TBST 洗滌3 次、每次15 min，按說明書稀釋并加入經辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育60 min，TBST 洗膜3 次、每次15 min，最后用化學發光顯影法進行顯影。于凝膠成像系統中采集圖像信息，以GAPDH 為內參，用Image J 軟件分析各組蛋白條帶的灰度值。

1.5 統計學方法 采用SPSS25.0 統計軟件。分別采用Κolmogorov-Smirnov檢驗、Levene檢驗對計量資料進行正態性檢驗和方差齊性檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠子宮內膜表面胞飲突發育情況 空白組子宮內膜表面形態規整，胞飲突豐富表達，圓潤飽滿，上皮細胞分布均勻，形態大小基本一致，細胞間界限清楚。模型組子宮內膜局部有少量胞飲突表達，形態大小不一，微絨毛較多，細胞間分界不清。婦科千金膠囊組及中藥低劑量組子宮內膜表面細胞形態欠規整，不飽滿，胞飲突發育較小，細胞界限欠清。中藥高、中劑量組子宮內膜表面形態較規整，細胞表面可見較多胞飲突，細胞之間的間隙明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠子宮內膜表面胞飲突表達情況（掃描電子顯微鏡）

2.2 各組大鼠子宮組織NF-κB、TGF-β1蛋白表達比較 見表1。

表1 各組大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1蛋白樣本表達比較（±s）

表1 各組大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1蛋白樣本表達比較（±s）

注：與模型組相比，#P＜0.01；與空白組相比，*P＜0.01。

組別中藥高劑量組中藥中劑量組中藥低劑量組婦科千金膠囊組模型組空白組n 10 10 10 10 10 10 NF-κB蛋白0.46±0.23#0.56±0.10#0.60±0.03 0.59±0.20#0.72±0.23*0.51±0.23 TGF-β1蛋白1.10±1.08#1.33±1.32#1.54±1.35 1.57±1.78#2.54±3.88*1.34±1.36

3 討論

CE 發病機制尚未完全闡明。研究表明，鏈球菌、大腸埃希菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌等病原微生物感染或單純皰疹病毒、巨細胞病毒等病毒感染與CE有關［12］。長期CE狀態引起的宮腔微環境改變會導致女性子宮內膜容受性降低，造成RIF、復發性流產等，危害女性身心健康［13］。目前西醫治療CE以控制炎癥、修復內膜為主，治療效果因人而異。婦科千金膠囊是治療CE的中成藥制劑，功效為清熱利濕，益氣化瘀，具有抑制細菌繁殖、減輕炎癥、調控免疫等作用［14］，屬于臨床婦科炎癥疾病的常用藥物。

CE 屬于中醫“帶下病”“婦人腹痛”“不孕癥”等范疇，多因經行、產后或產傷，感染病邪致濕熱下聚胞宮；或七情內傷，肝脾不調，疏運失常，濕熱循經下注，阻滯胞宮氣機，氣滯血瘀，內膜不得榮養；或由周圍炎癥蔓延而來，以致病邪侵襲內膜而致病。《傅青主女科》言：“帶下俱是濕證。”朱丹溪曾云：“血受濕熱，久必凝濁。”可見CE 病因病機以濕熱瘀阻為主，治療當以祛濕行瘀為主。李教授經驗方加味當歸芍藥散，以當歸芍藥散為基礎進行加減化裁，方中當歸補血活血，川芎行氣活血，赤芍涼血散瘀，丹參、紅花、桃仁活血祛瘀，茯苓、白術、黨參健脾滲濕，薏苡仁健脾利水、解毒散結，敗醬草清熱解毒、消腫排膿，甘草調和諸藥。全方以健脾除濕、活血化瘀為主要功效，契合CE的濕熱瘀結病機。

胞飲突被認為是評價子宮內膜容受性超微結構標志之一［15］。對于RIF 患者，胞飲突是預測胚胎植入時機的指標。足量的、發育成熟的胞飲突有利于胚胎著床，提高妊娠成功率［16］。本研究結果顯示，與空白組相比，模型組大鼠子宮內膜表面胞飲突發育不成熟且數量少；與模型組相比，中藥高、中劑量組大鼠子宮內膜表面胞飲突發育趨向成熟且數量較多，婦科千金膠囊組、中藥低劑量組子宮內膜表面胞飲突發育程度中等且數量較少。由電鏡結果可知，加味當歸芍藥散能夠有效改善胞飲突的發育程度。

NF-κB 是一種重要的細胞核轉錄因子，參與炎癥相關基因的轉錄調控，誘導趨化因子、生長因子、免疫受體、應激相關酶及急性期蛋白表達等，其可聚集炎癥細胞，從而引起一系列炎癥相關性疾病［17］。TGF-β1是TGF-β 家族中作用最強的一類相關生長因子，對細胞的生長分化、遷移、凋亡及細胞外基質生成均有調節作用。當機體發生炎癥反應性疾病時，TGF-β1表達增強，抑制T細胞和巨噬細胞的增殖和活性，從而抑制免疫作用，介導促炎因子的合成和分泌，加重炎癥反應的侵襲性與組織損傷。若TGFβ1高水平表達持續存在，會導致正常器官組織的纖維化［18-19］。因此，下調NF-κB、TGF-β1表達，可以抑制過度的免疫反應，從而減少炎癥介質的表達［20］。本研究結果顯示，模型組大鼠子宮組織中NF-κB、TGF-β1蛋白表達高于空白組，中藥高、中劑量組和婦科千金膠囊組NF-κB、TGF-β1蛋白表達低于模型組，提示加味當歸芍藥散可下調NF-κB、TGF-β1蛋白的表達，減輕CE 大鼠子宮內膜的炎癥反應，進而提高子宮內膜容受性。

結合上述研究結果，我們認為，CE 大鼠子宮內膜容受性下降與胞飲突發育不良及NF-κB、TGF-β1蛋白表達異常有關，而加味當歸芍藥散能夠通過改善CE 大鼠子宮內膜表面胞飲突的發育，并下調NF-κB、TGF-β1蛋白表達水平，從而有效改善CE 大鼠的子宮內膜容受性，這為中醫藥治療CE患者尤其是合并RIF的患者提供了研究基礎。