伏立諾他腹腔注射對嚴重燒傷早期大鼠心肌損傷和細胞凋亡的干預作用及其機制

孟祥熙，溫海玲，鄭金光，吳忠隱，胡森，孫奎

1 承德醫學院附屬醫院燒傷整形科，河北承德067000；2 解放軍總醫院第四醫學中心燒傷整形醫學部；3 承德醫學院附屬醫院血管外科；4 解放軍總醫院醫學創新研究部創傷修復與組織再生研究中心

嚴重燒傷早期，心肌結構損傷，心肌細胞凋亡，心功能降低，誘發或加重休克，早期心肌損害和功能減退也是缺血缺氧的啟動因素之一［1-2］。早期心肌細胞凋亡是心肌損傷及其并發癥發生、發展的重要病理機制［3］。嚴重燒傷早期心功能受損，進一步加重休克，如果早期給予抗休克維持藥物，保護心臟功能，能為后續治療爭取時間，提高救治成功率及生存率。伏立諾他（SAHA）是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑。組蛋白3 第9 位乙酰化的賴氨酸（Ac-H3K9）是反映機體組蛋白乙酰化水平的一個可靠指標。以往研究證實，SAHA 能提高膿毒性休克小鼠的生存率，延長生存時間［4］，保護致死性燙傷大鼠心臟功能［5］，預防缺血—再灌注引起的心肌細胞內線粒體功能障礙［6］，但具體機制仍不明確。2018 年7 月—2020 年9 月，本研究觀察了SAHA 對50% TBSA Ⅲ°燙傷大鼠心肌損傷和心肌細胞凋亡的干預作用，并探討相應機制，為SAHA 在嚴重燒傷早期保護心臟功能、抑制心肌細胞凋亡的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 雄性SD 大鼠24 只，60～70日齡，體質量240～260 g，適應性飼養1 周以上，室溫22 ～25 ℃，自由飲食。實驗前12 h 禁食，自由飲水。SAHA、戊巴比妥鈉購自Sigma 公司。Cleaved Caspase-3 Rabbit mAb 購 自Cell Signaling 公司。TUNEL檢測陽性對照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。一氧化氮（NO）檢測試劑盒購自南京建成生物工程公司。誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）抗體購自Abcam 公司。兔抗大鼠Ac-H3K9 抗體購自英國Abcam 公司。小鼠抗大鼠GAPDH 抗體、辣根過氧化物酶標記的二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。肌酸激酶同工酶（CK-MB）測定試劑盒購自上海執誠生物科技有限公司。

1.2 動物分組及造模、給藥方法 取24 只大鼠，隨機分為假燙組、燙傷組和SAHA 組，每組8 只大鼠。戊巴比妥鈉50 mg/kg 腹腔麻醉，剪除背部和腹部毛發，將大鼠放置在預制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時保護剩余皮膚。燙傷組、SAHA 組建立燙傷大鼠模型：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s造成50%TBSA Ⅲ°燙傷（燙傷深度經病理組織切片檢查證實）。燙傷組和SAHA 組傷后分別于腹腔內注射0.25 mL 生理鹽水和7.5 mg/kg 的SAHA（溶于0.25 mL 生理鹽水）。假燙組采用37 ℃水浴，背部15 s，腹部8 s，處理后腹腔內注射0.25 mL 生理鹽水。本實驗動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.3 血漿CK-MB 檢測 各組于傷后6 h 抽取腹主動脈血標本，離心后取血漿，全自動生化分析儀測定血漿CK-MB，評價心肌損傷程度。

1.4 心肌細胞凋亡率測算 各組于傷后6 h行腹主動脈穿刺，抽取血標本，然后處死動物，胸正中線剖開取心肌組織，TUNEL 法檢測凋亡心肌細胞，熒光顯微鏡下觀察，隨機選取心肌組織區域中5 個非重疊高倍鏡視野，計數凋亡心肌細胞數和心肌細胞總數，計算心肌細胞凋亡率。

1.5 心肌細胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 檢測 采用Western blotting 法檢測心肌細胞中的Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9蛋白。取100 mg 大鼠心肌組織，加入1 mL 的RIPA 裂解液勻漿，于冰上靜置20 min 后12 000 g 離心20 min，吸取上清并用BCA法進行蛋白濃度測定。行常規聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉封閉60 min 后分別加入相應一抗（GAPDH 抗體1∶5 000，iNOS 抗體1∶400，Caspase-3 抗體1∶1 000，Ac-H3K9 抗體1∶400），4 ℃孵育過夜。TBST 洗15 min、共3 次，分別加入相應二抗（1∶5 000），室溫孵育30 min，TBST 洗15 min、共3次。用超敏ECL 發光液發光、曝光、顯影、定影，用Image J 軟件分析條帶灰度，以目的蛋白條帶與內參蛋白條帶灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。采用NO 檢測試劑盒測定心肌細胞中的NO，按照試劑盒說明書操作。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0 統計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血漿CK-MB 水平比較 假燙組、燙傷組、SAHA 組血漿CK-MB 水平分別為（585.6 ±46.1）、（5418.7 ± 292.9）、（3 475.3 ± 187.5）U/L。燙傷組血漿CK-MB 水平高于假燙組，SAHA 組血漿CK-MB水平低于燙傷組（P均＜0.05）。

2.2 各組心肌細胞凋亡情況比較 正常心肌組織結構排列整齊、緊密。燙傷后，心肌纖維出現扭曲、變形，間質出現充血、水腫，甚至肌纖維斷裂，心肌細胞出現凋亡。給予SAHA 處理后，心肌病理變化和間質水腫較燙傷組明顯減輕，心肌纖維排列較整齊。假燙組、燙傷組、SAHA 組心肌細胞凋亡率分別為0.6%±0.1%、21.5%±1.2%、15.1%±0.9%，燙傷組心肌細胞凋亡率高于假燙組，SAHA 組心肌細胞凋亡率低于燙傷組（P均＜0.05）。

2.3 各組心肌細胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO 表達比較 燙傷組心肌細胞中Caspase-3、iNOS、NO蛋白表達高于假燙組，Ac-H3K9蛋白表達低于假燙組（P均＜0.05）；SAHA 組Caspase-3、iNOS、NO 表達低于燙傷組，Ac-H3K9 表達高于燙傷組（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠心肌細胞中Caspase-3、iNOS、Ac-H3K9、NO表達比較（xˉ± s）

3 討論

嚴重燒傷早期，大量液體滲出，有效循環血量銳減，組織缺血，影響細胞代謝和臟器功能，直接導致心肌損傷；同時由應激反應、再灌注損傷、失控性炎癥反應等，致血管內皮細胞、中性粒細胞結構和功能改變，進一步引起微循環障礙，由此加重心肌的缺血缺氧和心肌損害［7-9］。嚴重燒傷早期即出現心肌細胞凋亡，造成心肌不可逆損傷，是心肌損傷的病理基礎。在燒傷休克早期，如果給予抗休克維持藥物，提高心肌細胞對缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌細胞凋亡，進而保護心臟功能，有助于提高患者生存率，降低后期救治難度。

伏立諾他是一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑，已被美國FDA批準用于皮膚T細胞淋巴瘤的治療。研究發現，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠調節組蛋白乙酰化水平，調控基因表達。在嚴重燒傷及失血性休克的動物模型中，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能提高動物生存率、提高心肌內組蛋白的乙酰化修飾水平、保護心臟功能［10-12］。在大鼠心肌梗死模型中，SAHA 能抑制組蛋白去乙酰化酶活性，誘導熱休克蛋白的表達，維持心肌細胞穩定［13］。在小鼠缺血—再灌注損傷模型中，SAHA 能阻止缺血—再灌注引起的心肌細胞內線粒體功能障礙和丟失［6］。

SAHA 對致死性燙傷大鼠心臟保護作用的相關研究較少。本研究建立了無靜脈補液條件下致死性燙傷大鼠模型，結果顯示，在大鼠致死性燙傷后，血漿CK-MB 水平明顯升高，心肌纖維排列紊亂、斷裂，間質充血、水腫，心肌細胞凋亡率顯著升高；給予SAHA 治療后，CK-MB 水平降低，心肌損傷及間質水腫減輕，心肌細胞凋亡率下降。這提示SAHA 能保護心肌結構完整，抑制嚴重燙傷大鼠心肌細胞凋亡，進而保護心臟功能。

組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶通過調節組蛋白乙酰化水平，對維持細胞正常功能有重要作用。正常情況下，組蛋白乙酰轉移酶和組蛋白去乙酰化酶蛋白的結構和酶活性保持高度平衡，稱為乙酰化動態平衡。當機體在創傷、缺血缺氧的情況下，這種平衡被打破［14］。研究表明，在心肌梗死與缺血再灌注損傷過程中，組蛋白去乙酰化酶活性降低，而給予組蛋白去乙酰化酶抑制劑后，可顯著減少心肌梗死面積，減輕心臟損傷［15］。以往研究顯示，Ac-H3K9 能反映心肌組織中組蛋白乙酰化水平［16］。本研究結果顯示，燙傷組傷后6 h，心肌細胞中Ac-H3K9 蛋白表達較假燙組降低，而給予SAHA 處理的大鼠心肌細胞中Ac-H3K9 表達升高，表明SAHA 可能通過提高燙傷后大鼠心肌內組蛋白乙酰化水平，維持心肌細胞穩定，抑制心肌細胞凋亡，保護心臟結構。

Caspase-3 是促進細胞凋亡的重要因子，其活化后剪切PARP，使核小體間的DNA 裂解，引起心肌細胞凋亡，造成心肌細胞的不可逆損傷，進而影響心臟功能［17］。在本研究中，燙傷組傷后心肌細胞Caspase-3 蛋白表達增高，SAHA 組Caspase-3 表達較燙傷組降低，表明SAHA 有助于抑制Caspase-3 生成，從而減少心肌細胞凋亡。在心衰、心肌缺血—再灌注損傷、嚴重燒傷過程中，心肌細胞缺血缺氧，早期心肌細胞p53 激酶明顯活化［18］，上調iNOS 表達，引起心肌細胞凋亡［19］；iNOS 高表達進一步誘導心肌細胞內NO 生成增多，NO 通過調控細胞凋亡信號通路的多個途徑來促進細胞凋亡。研究表明，高水平的NO 可以直接誘發心肌細胞凋亡［20］。本研究結果顯示，與假燙組比較，燙傷組在傷后心肌細胞中iNOS蛋白表達及NO 水平明顯增加，而給予SAHA 處理后，iNOS、NO 水平均顯著降低，提示SAHA 可能通過減少心肌細胞中iNOS蛋白表達及NO生成從而減少心肌細胞凋亡。

綜上所述，SAHA 能夠抑制50% TBSA Ⅲ°嚴重燙傷大鼠心肌細胞凋亡，從而保護心臟功能。其作用機制可能與增加心肌細胞中組蛋白乙酰化水平，下調Caspase-3、iNOS蛋白表達及NO含量有關。