輕度認知功能障礙患者腸道菌群豐度變化及健脾補腎中藥復方還少丹干預效果觀察

陳穎，劉雪輝

1 成都中醫藥大學臨床醫學院，成都610075；2 成都中醫藥大學附屬醫院老年干部科

輕度認知功能障礙（MCI）被認為是介于生理衰老與癡呆的中間狀態，屬于一種神經系統退行性病變。MCI 患者是阿爾茨海默病（AD）發病的高危人群。流行病學資料顯示，每年有10 %～15 %的MCI患者可進展為AD［1］。近年研究表明，腸道微生物群能通過“腸道—微生物群—腦軸”途徑與神經功能相互影響，腸道微生態紊亂可能與MCI 的發生或進展有關［2］。MCI 可歸屬于中醫學“健忘”“善忘”等范疇。研究發現，脾腎兩虛證與患者總體認知損害相關，且年齡越大則脾腎兩虛證越嚴重［3-4］。相關藥理研究發現，健脾補腎類中藥復方能改善學習認知功能，并與腸道微生物相互作用，影響腸道內環境，有助于益生菌生長，充當益生元的角色［5］。本研究旨在觀察MCI患者腸道菌群豐度變化及中醫健脾補腎法的干預效果，以期進一步揭示MCI的發病機制，為還少丹治療MCI 提供科學依據，也為MCI 的治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2020年12月—2021年6月成都中醫藥大學附屬醫院門診、住院及醫院周邊社區的MCI 患者24 例作為研究對象。納入標準：①符合MCI的診斷標準；②符合中醫脾腎陽虛證診斷標準；③年齡在50 ～85歲，男女均可；④自愿參加本研究，并簽署知情同意書。排除標準：①評定為正?；虬V呆者；②目前患者有精神分裂癥、分裂情感性障礙或原發性成人情感性障礙，包括有成人情感性障礙病史者或伴有嚴重神經缺損患者，如各種失語、失認者；③患有AD、血管性癡呆、中樞神經系統感染、創傷后癡呆、中毒代謝性腦病、亨廷頓病、多發性硬化、震顫性麻痹等且診斷在記憶衰退之前，精神發育不全、原發的未經治療的內分泌疾病如Cushing綜合征或原發下丘腦功能減退（甲狀腺機能減退已治愈者不除外）；④合并有心、腦、肝、腎和造血系統嚴重原發疾病患者；⑤有嚴重消化不良、胃腸道梗阻、消化道潰瘍的患者，合并其他影響藥物吸收的胃腸道疾病患者；⑥對本研究藥物過敏者；⑦近期曾系統接受過其他中西醫益智藥物及口服益生菌治療的患者。采取隨機數字表法將MCI患者分為觀察組和對照組各12 例。觀察組男4 例、女8 例，年齡（80.33 ±8.55）歲，BMI 22.30 ± 2.19，受教育程度為中學及以上9 例、小學3 例。對照組男5 例、女7 例，年齡（83.33 ± 7.13）歲，BMI 22.74 ± 2.74，受教育程度為中學及以上10 例、小學2 例。兩組患者性別、年齡、BMI、受教育程度等基線資料差異無統計學意義。另選同期來院體檢的健康人12 例作為健康對照組，男7 例、女5 例，年齡（79.08 ± 4.56）歲，受教育程度為中學及以上9例、小學3例。本研究遵循赫爾辛基宣言，獲得成都中醫藥大學附屬醫院倫理委員會審查批準（倫理批準號2020KL-081）。研究期間觀察組和對照組無脫落、失訪病例。

1.2 腸道菌群豐度及生物信息學分析 對MCI 患者和健康對照組的腸道菌群分布進行分析。根據相似度水平差異，對16S rDNA 測序得到的全部序列進行運算分類單元（OTU）聚類分析，利用USEARCH軟件在97%相似度下聚類得到OTU 代表序列，與數據庫比對，進行OTU 物種注釋?；贠TU 和注釋結果進行α 多樣性、β 多樣性、組間物種差異、功能差異等分析。α 多樣性分析反映群落的豐度和多樣性，常用包括Shannon 指數、Simpson 指數。利用QIIME2 軟件計算Weighted Unifrac 距離矩陣分析β多樣性。應用LEfSe 分析組間差異菌群，默認線性判別分析篩選值為2.0（≥2.0被認為差異顯著）。采用PICUSt 軟件對樣本中可能存在的腸道菌群對應各級KEGG通路及豐度值進行預測。

1.3 健脾補腎法中藥復方干預觀察

1.3.1 治療方法 對照組予以基礎治療，包括一般健康養生宣教（積極調治舊疾，保持心情舒暢）；八段錦鍛煉，每日1 次，每次30 min。觀察組基礎治療同對照組，同時予以中藥還少丹免煎顆粒（由四川新綠色藥業科技發展有限公司提供）。還少丹藥物組成：熟地黃15 g、枸杞子15 g、肉蓯蓉10 g、巴戟天10 g、懷牛膝10 g、山茱萸10 g、五味子10 g、山藥10 g、茯苓10 g、遠志10 g、石菖蒲10 g、法半夏10 g、杜仲10 g、楮實子10 g。每日1 劑，每 日3 次，于三餐后30 min 以100 mL 溫開水沖化后口服。兩組療程均為12周。

1.3.2 認知功能評估方法 在治療前及療程結束后采用簡易精神狀態量表（MMSE）評分和蒙特利爾認知評估量表（MoCA）評分評價認知功能。

1.3.3 中醫證候積分方法 根據《中藥新藥臨床研究指導原則》及《輕度認知損害臨床研究指導原則》制訂的中醫證候積分表，依據主要癥狀、次要癥狀的嚴重程度分別賦分（主要癥狀賦0、2、4、6分，次要癥狀賦0、1、2、3分），采用尼莫地平法進行評價。

1.3.4 療效評估方法 根據《中藥新藥臨床研究指導原則》及《輕度認知損害臨床研究指導原則》，患者癥狀、體征消失或基本消失，療效指數≥80%為臨床控制；患者癥狀、體征明顯改善，50%≤療效指數＜80%為顯效；患者癥狀、體征均好轉，30%≤療效指數＜50%為有效；患者癥狀、體征無明顯改善或加重，療效指數＜30%為無效。

1.3.5 治療安全性評價方法 兩組治療期間檢測血常規、尿常規、大便常規、肝功能（ALT、AST）、腎功能（BUN、Cr），并進行心電圖檢查。記錄不良反應發生情況。

1.3.6 腸道菌群豐度檢測方法 采集觀察組和對照組新鮮糞便，在4 h 內放入-80 ℃冰箱凍存。對基因組DNA 樣品進行提取、擴增，Agencourt AMPure XP 磁珠對PCR 擴增產物進行純化，完成建庫，選擇HiSeq 平臺進行測序。下機數據過濾，得到高質量Clean data，使用FLASH1.2.11 軟件，利用重疊關系將reads 進行拼接，得到高變區的Tags，將Tags 聚類成運算分類單元。采用Mothur 方法與SILVA（http：//www.arb-silva.de/）的SSUrRNA 數據庫進行物種分類學分析（設定閾值為0.8 ～1.0）。

1.4 統計學方法 采用SPSS25.0統計軟件。計量資料進行Kolmogorov-Smirnov正態性檢驗，符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；不符合正態分布的計量資料組內比較采用Wilcoxon秩和檢驗，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。計數資料采用χ2檢驗。MoCA、MMSE 評分與腸道菌群分布的相關性采用Spearman 相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MCI 患者腸道菌群豐度變化 MCI 患者及健康受試者腸道中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門是優勢菌門。與健康對照組相比，MCI患者厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、疣微菌門豐度增加，而擬桿菌門豐度降低?；赪eighted Unifrac 距離的主坐標分析及差異盒型圖的β 多樣性分析顯示，MCI 患者與健康對照組腸道菌群構成存在差異，門、綱及科水平的菌群組成不同。草酸桿菌科、草酸桿菌屬、梭狀芽胞桿菌屬、大芬戈爾德菌、帕拉普菌屬、Odoribacter、Oribacterium、巴斯德菌科、巴斯德菌目、嗜血桿菌屬、艾森伯格菌屬是差異顯著種群。MCI 患者艾森伯格菌屬、變形菌門下的巴斯德菌科及嗜血桿菌屬富集。應用各級KEGG 預測MCI患者與健康對照組差異分布腸道菌群對應的功能類別，兩組有8 條通路差異具有統計學意義，分別為檸檬酸鹽循環、玉米素生物合成、糖酵解/糖異生、丙酮酸代謝、真核生物的核糖體生物發生、原核生物中的碳固定途徑、β-丙氨酸代謝、N-聚糖生物合成。兩組差異分布腸道菌群在氨基酸、脂肪、碳水化合物、核苷酸、萜類和多酮類代謝相關的微生物功能存在差異。

2.2 MCI 患者健脾補腎法治療效果 觀察組治療后MMSE、MOCA 評分高于對照組，中醫證候積分低于對照組（P均＜0.05）。見表1。治療12 周后，觀察組臨床控制1例、顯效9例、有效1例、無效1例，總有效率91.67%；對照組顯效4 例、有效1 例、無效7 例，總有效率41.67%。觀察組總有效率高于對照組（P＜0.05）。研究過程中，兩組患者生命體征、血常規、肝腎功能、心電圖檢查均未出現明顯異常。

表1 兩組MCI患者治療前后MMSE、MOCA評分及中醫證候積分比較（分，±s）

表1 兩組MCI患者治療前后MMSE、MOCA評分及中醫證候積分比較（分，±s）

注：與同組治療前相比，*P＜0.05；與對照組治療后相比，#P＜0.05。

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后n 12 12 MOCA 評分20.58±2.11 22.42±2.02*#20.33±2.27 20.42±2.31 MMSE評分23.67±0.99 25.42±0.67*#24.00±0.74 24.17±1.27主要癥狀積分11.80±1.80 4.17±1.80 11.60±1.88 6.50±2.71次要癥狀積分16.75±2.14 5.75±2.83 16.42±2.81 11.58±3.84總體積分28.58±2.84 9.92±3.87*#28.08±3.53 18.08±6.42*

2.3 MCI 患者健脾補腎法治療前后腸道菌群豐度變化 在門種水平上，兩組MCI 患者治療后厚壁菌門、放線菌門、疣微菌門、變形菌門豐度下降，擬桿菌門豐度增加（P均＜0.05）；在屬種水平上，觀察組治療后梭狀芽胞桿菌屬、Oribacterium 豐度增加，嗜血桿菌屬豐度降低（P均＜0.05）。對照組治療前后差異無統計學意義。MCI 患者治療后腸道菌群在門種水平上與健康對照組差異無統計學意義；在屬種水平上，MCI 患者治療后梭狀芽胞桿菌屬、Oribacterium 豐度低于健康對照組，嗜血桿菌屬、艾森伯格菌屬豐度高于健康對照組（P均＜0.05）。見表2、表3。

表2 三組腸道菌群門種豐度比較（±s）

表2 三組腸道菌群門種豐度比較（±s）

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后健康對照組n 12 12 12厚壁菌門50.482±7.438 47.053±9.375 50.316±8.013 48.749±7.723 45.080±5.342擬桿菌門19.836±6.905 28.961±4.070 18.949±6.181 20.592±6.690 39.847±7.032放線菌門5.064±5.860 3.026±4.329 5.681±6.045 4.777±5.998 1.490±1.747疣微菌門3.679±2.136 1.868±0.907 3.277±1.903 2.027±1.664 2.150±1.990變形菌門18.428±6.529 13.596±8.033 18.869±5.805 15.119±6.340 11.274±6.888

表3 三組腸道菌群屬種豐度比較（±s）

表3 三組腸道菌群屬種豐度比較（±s）

注：與健康對照組相比，*P＜0.05；與對照組相比，#P＜0.05；與同組治療前相比，△P＜0.05；0代表樣本物種豐度極小，忽略不計。

組別觀察組治療前治療后對照組治療前治療后健康對照組n 12 12 12艾森伯格菌屬0.075±0.064*0.067±0.166*0.074±0.171*0.070±0.165*0.031±0.069梭狀芽胞桿菌屬1.584±0.602*2.464±2.678#△1.588±0.413*1.589±0.412*2.682±1.575嗜血桿菌屬0.467±0.625*0.019±0.033#△0.477±0.825*0.423±0.850*0.018±0.031 Oribacterium 0*0.001±0.001#△0*0*0.001±0.002

2.4 MCI 患者MOCA、MMSE 評分與腸道菌群豐度的相關性 相關性分析結果顯示，MCI 患者擬桿菌門豐度與MMSE 評分呈正相關（r=0.398，P＜0.05），梭狀芽胞桿菌屬豐度與MOCA、MMSE 評分呈正相關（r分別為0.388、0.422，P均＜0.05），嗜血桿菌屬、艾森伯格菌屬豐度與MOCA 評分呈負相關（r分別為-0.372、-0.373，P均＜0.05）。

3 討論

人體與微生物密不可分，人體內最大、最復雜的微生態系統位于胃腸道，由于面積廣、菌種繁多復雜，被稱為“人體第二基因組”。微生物尤其是腸道微生物與參與人體的新陳代謝，影響營養吸收和代謝，與健康息息相關。越來越多的研究表明，腸道菌群在認知功能障礙的發生發展中有重要作用［6］。腸道菌群影響認知功能的機制主要集中在以下幾方面［7-9］：菌群產生短鏈脂肪酸及脂多糖等成分影響中樞神經系統；腸道菌群產生神經遞質調節大腦記憶功能；腸道微生態平衡破壞可刺激炎癥因子損害血腦屏障，導致神經退行性變，影響認知功能。

既往研究發現，成年人腸道菌群中厚壁菌門及擬桿菌門是主要菌群，約占細菌組成的90%，其他變形菌門、放線菌門等比例較?。?0］。變形菌門是細菌中最大的門，在健康成人腸道中占比較小，其富集被認為與腸道菌群失調密切相關［11-12］。變形菌門細胞壁富含高度炎癥成分（如脂多糖），可誘導低級別全身炎癥，加重認知障礙。本研究結果顯示，MCI組腸道微生物α 多樣性總體指數稍低，擬桿菌門等有益菌比例明顯降低，而促進炎癥的微生物群如變形菌門等有害菌比例明顯升高；觀察組治療后變形菌門豐度下降，擬桿菌門等有益菌腸道菌群多樣性更為豐富，屬種水平上梭狀芽胞桿菌屬、Oribacterium 豐度增加，嗜血桿菌屬豐度降低。一項研究發現，MCI患者腸道厚壁菌門、變形菌門豐度增高，擬桿菌門豐度降低，與本研究結果一致［13］。本研究中，MCI患者菌群特征主要表現為艾森伯格菌屬及變形菌門下γ-變形菌綱的巴斯德菌科、嗜血桿菌屬富集，梭狀芽胞桿菌屬、Oribacterium 減少，提示MCI 患者存在腸道菌群失衡。嗜血桿菌屬是常寄生于上呼吸道的條件致病菌［14］，在MCI患者腸道中，其豐度高于健康對照組，提示MCI 患者胃腸道可能被定植在身體其他部位的微生物入侵，其表面的多糖成分在感染過程中起關鍵作用［15］。已有研究表明，致病菌或腸道菌群失調可導致血腦屏障通透性增加，而腸道屏障和血腦屏障受損或改變可能有利于微生物繁殖，代謝物生成增多，抗原或激活的免疫復合物可從腸道到血液循環系統，最終到達包括腦實質在內的其他組織，引起神經炎癥，導致神經退行性變［16］。KEGG 分析顯示，MCI 患者差異表達腸道菌群的微生物功能主要涉及氨基酸、脂肪、碳水化合物、核苷酸、萜類和多酮類等代謝方面［17］，提示腸道微生物可直接或間接通過多種途徑與中樞神經系統相互作用，具體菌種及代謝機制需進一步深入研究。

MCI 可歸屬于中醫學“健忘”“善忘”等范疇，其病位在腦，與心肝脾腎功能失調密不可分，尤其是脾腎。中醫認為腦為元神之府，精髓之海，賴腎精充養。腎藏精，精生髓，上輸于腦，精足髓充，令人智慧靈活；若腎精虧虛，髓減腦消，則神明失養。脾為后天之本，氣血生化之源，脾氣與腎氣相互充養，若脾氣虛弱，一則氣血生化不足，腎精失養，二則積飲為痰，痰蒙腦竅。因此，臨證多健脾補腎以治本。

還少丹見于《楊氏家藏方》，也見于《洪氏集驗方》，可用于補益脾腎，治療未老先衰、神志俱耗、體倦腰酸等多種因脾腎虛弱導致的證候。方中熟地黃滋養先天之本，能“封填骨髓”；現代藥理證實，熟地黃中梓醇能抑制氧化應激，延緩認知障礙的進展［18］。枸杞子入足少陰腎經，陶通明言其“補益精氣，強盛陰道”，與熟地合用補腎水以濟命火，使火不亢不害。杜仲、懷牛膝補腎壯腰膝。茯苓、山藥均入脾、腎經，《用藥心法》稱茯苓為“除濕之圣藥”，其水煎液能降低腦內乙酰膽堿酯酶活性［19］，改善小鼠記憶力，茯苓與山藥合用可補中健脾。山茱萸、五味子收澀而固精。遠志、石菖蒲是多數醫家治療健忘常用藥物，《神農本草經》中記載遠志“益智慧，耳目聰明，不忘，強志倍力”；石菖蒲中β-細辛酮有保護心腦血管和神經的作用，有助于治療記憶障礙［20］。楮實子助陽補虛，交補脾腎，法半夏燥濕健脾。諸藥合用，全方共奏補益脾腎之效。既往研究發現，還少丹可以減低N-甲基-D-天冬氨酸受體活性，增強腦內過氧化氫酶的活性，促進乙酰膽堿合成，改善學習和記憶能力［8］。本研究結果顯示，觀察組MOCA、MMSE評分及總有效率高于對照組，中醫證候積分下降更顯著，表明還少丹能有效改善MCI 患者的認知功能。觀察組治療后變形菌門、嗜血桿菌屬豐度明顯減少，擬桿菌門、梭狀芽胞桿菌屬、Oribacterium 豐度增加，提示還少丹可一定程度改善MCI患者腸道微生物平衡。相關性分析結果顯示，MCI 患者擬桿菌門豐度與MMSE 評分呈正相關，梭狀芽胞桿菌屬豐度與MOCA、MMSE 評分呈正相關，嗜血桿菌屬、艾森伯格菌屬豐度與MOCA 評分呈負相關，提示腸道菌群與認知障礙進展存在一定聯系。

綜上所述，MCI 患者與健康人腸道菌群豐度存在明顯差異，且差異菌群與認知功能相關。還少丹可以安全、有效改善MCI 認知功能，減輕臨床證候，其作用機制可能與調節患者腸道菌群有關。MCI患者與正常人的差異腸道菌群有望成為研究及治療MCI的潛在靶點。還少丹治療MCI的其他機制還有待進一步研究。鑒于本研究樣本量小，以上結論尚需大樣本研究加以驗證。