miRNA-31-5p和SATB2的表達對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響機制

阿布都熱合曼·買買提 戚峰

作者單位：①天津醫科大學研究生學院（天津市300070）；②天津醫科大學總醫院普外科

乳腺癌嚴重威脅著女性的健康。研究顯示，腫瘤的再次復發以及靶器官轉移是導致晚期乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。深入揭示乳腺癌的發病、轉移的分子機制，對于提高晚期乳腺癌患者的生存具有重要的臨床價值。研究顯示，微小RNA（microRNA，miRNA）通過調控靶基因的表達，發揮促癌或抑癌的調控功能[2]。miRNA-31-5p在胃癌、骨肉瘤、卵巢癌、前列腺癌等腫瘤中顯示了良好的抑癌效用[3]。核基質結合蛋白質2（special AT-rich sequence-binding protein 2，SATB2）是一種核轉錄因子，在遺傳物質的重組和轉錄過程中發揮重要作用。Assarzadegan 等[4]通過對臨床乳腺癌標本行免疫組織化學法染色顯示，SATB2在乳腺癌中的表達明顯升高，并與患者的不良預后密切相關，但并未深入揭示其表達與腫瘤細胞的增殖與轉移的關系。本課題組前期通過對基因表達綜合數據庫（GEO）中提取乳腺癌數據集GSE24124、GSE70947、GSE42568 進行分析顯示，miRNA-31-5p在乳腺癌中的表達明顯降低，SATB2 基因的表達明顯升高，并且兩者的異常表達均與患者的預后關系密切。本研究通過對臨床樣本、乳腺癌細胞系的研究，探討miRNA-31-5p和SATB2的表達對乳腺癌細胞增殖和遷移的影響機制，為揭示乳腺癌的分子機制提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 乳腺癌組織樣本 選取2017年3月至2020年12月于天津醫科大學總醫院收治的外科切除的80例乳腺癌患者的臨床病理資料，平均年齡為（48.22±17.62）歲，所有入選樣本均未經放化療干預，組織病理學確診為乳腺癌，另外選取80例相應的癌旁組織（遠離病灶位置超過2 cm 以上）。所有樣本收集后，以多聚甲醛固定，采用定量反轉錄-聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測。本研究獲得本院倫理委員會批準及患者的知情同意。

1.1.2 實驗細胞 乳腺癌MCF-7、MDA-MB-468、MDA-MB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 細胞株以及乳腺正常上皮細胞MCF-10A 均購自中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞資源中心。miRNA-31-5p 激動劑（miRNA-31-5p-agomir）和miRNA-31-5pagomir 對照（miRNA-31-5p-agomir-NC）以及pcDNA3.1-SATB2 由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.1.3 實驗動物 40 只（20±2）g的SPF 級雌性BALB/c 裸鼠均購自北京北方艾特生物科技有限公司，動物的生產許可證號為SCXK（京）2020-0005，并獲得本院倫理委員會批準。

1.1.4 試劑與儀器 FBS、PBS 均購自美國CST 公司，GAPDH 抗體、SATB2、相關蛋白E-鈣黏蛋白（Ecadherin）和波形蛋白（Vimentin）抗體均購自美國Invitrogen 公司，Western blot 試劑盒、Transwell 小室、EDU 增殖試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司。C150 細胞培養箱購自德國Binder 公司，全自動凝膠成像系統、qRT-PCR 擴增儀均購自美國Bio-Rad 公司，光學顯微鏡購自日本Olympus 公司。

1.2 方法

1.2.1 qRT-PCR 檢測 Trizol 試劑盒分別提取樣品的總RNA，確定其完整性和濃度后[5]，PCR 儀擴增。參照物GAPDH的上游序列為 5′-CCTATGTGCAGAGGAATTATGATCTTT-3′，下游序列為5′-CCACTGTGTTGAGGGCAATG-3′；miRNA-31-5p的上游序列為5′-GCAGACCGTTCGTCAACCTA-3′ ，下游序列為5′-AATTCTGTTTGCGGTGCGTC-3′；SATB2的mRNA上游序列為 5′-AACAGGAGGTCCCTACTCCC-3′，下游序列為5′-GCCATTTTGCGGTGGAAATG-3′。2?△△CT表示目的基因的相對表達量，△△CT=△CT（標準基因）?△CT（目的基因）。

1.2.2 雙熒光素酶實驗 TargetScanHuman 7.2 數據庫（http://www.targetscan.org/vert_72/）預測miRNA-31-5p和SATB2的結合位點。采用雙熒光素酶實驗，將過表達miRNA-31-5p的質粒以及其對照分別與野生型（pGL3-SATB2-3-UTR-MUT）和突變型（pGL3-SATB2-3-UTR-WT）進行共轉染，培養細胞48 h 后，洗滌細胞，加入適量裂解液，進行熒光素酶活性測定。

1.2.3 細胞轉染實驗 分組取對數生長期的MDAMB-231 細胞進行如下轉染：正常組細胞常規培養，不進行任何干預；miRNA-31-5p-agomir 對照組細胞轉染miRNA-31-5p-agomir-NC；miRNA-31-5p 激動劑組細胞轉染miRNA-31-5p-agomir；pcDNA3.1 組細胞轉染miRNA-31-5p-agomir+pcDNA3.1-SATB2。

1.2.4 EDU 染色實驗 細胞分組處理同1.2.3，37℃，5%CO2條件下培養24 h，每孔加入100 μL的EDU染色液，室溫孵育2 h，避光、孵育后，鏡檢，Image J 軟件統計分析各組細胞EDU 陽性細胞的比例。

1.2.5 Transwell 小室實驗 細胞分組處理同1.2.3，以無血清培養基懸浮細胞至1×105/mL，并接種在預先鋪好50 μL的matrigel 基質膠的Transwell 小室上室中，37℃、5%CO2條件下進行培養24 h，經染色后，光學顯微鏡下觀察，并行統計計數。

1.2.6 裸鼠皮下種植乳腺癌模型 將BALB/c 裸鼠隨機分為正常組、miRNA-31-5p-agomir 對照組、miRNA-31-5p 激動組和pcDNA3.1 組，每組10 只。細胞分組處理同1.2.3，37℃、5%CO2條件下進行培養24 h，PBS 重懸細胞至4×107/mL，將100 μL的各組細胞皮下注射至對應組裸鼠的右側前下肢外側，同時腹腔注射適量的熒光劑Luciferin，連接活體成像系統（IVIS），以監測癌細胞的轉移情況。各組裸鼠常規培養4 周后，處死，剝離腫瘤組織，天平稱重，同時將瘤體組織進行Western blot 實驗。

1.2.7 Western blot 實驗 瘤體組織或細胞中添加適量的組織裂解液，提取其總蛋白，經電泳分離，轉膜，封閉，加入一抗（1∶500），孵育，加入二抗（1∶1 500），化學發光后，顯影，以GAPDH 作為參照分析各條帶的灰度值。

1.3 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，采用Graphpad8.1 進行作圖。符合正態分布的實驗數據采用±s進行表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 乳腺癌組織和乳腺癌細胞系中miRNA-31-5p和SATB2的表達

qRT-PCR 結果顯示，與癌旁組織以及乳腺正常上皮細胞MCF-10A 相比，miRNA-31-5p在乳腺癌組織以及乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDAMB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 中的表達明顯降低，SATB2mRNA 表達明顯升高，差異均具有統計學意義（均P<0.05，圖1）。因MDA-MB-231 細胞表現的差異最為明顯，后續實驗均使用MDA-MB-231 細胞。

2.2 雙熒光素酶實驗

TargetScanHuman 7.2 數據庫中顯示，miRNA-31-5p和SATB2 存在特異性結合的序列（圖2A）。雙熒光素酶實驗結果顯示，野生型SATB2的熒光素酶活性在轉染miRNA-31-5p 模擬物后明顯降低（P<0.05），突變型SATB2 熒光素酶活性無明顯變化（P>0.05），說明miRNA-31-5p和SATB2 具有靶向調控關系（圖2B）。

2.3 miRNA-31-5p 靶向SATB2 調控MDA-MB-231細胞的體外增殖與轉移

EDU 染色實驗結果顯示，與正常組相比，miRNA-31-5p 激動劑組、pcDNA3.1 組中EDU 陽性細胞的比例明顯降低，與miRNA-31-5p 激動劑組相比，pcDNA3.1 組EDU 陽性細胞的比例明顯升高，差異均具有統計學意義（均P<0.05，圖3A）；Transwell 小室實驗結果顯示，與正常組相比，miRNA-31-5p 激動劑組、pcDNA3.1 組遷移細胞的數量明顯減少，與miRNA-31-5p 激動劑組相比，pcDNA3.1 組遷移細胞的數量明顯增多，差異均具有統計學意義（均P<0.05，圖3B）；Western blot 結果顯示，與正常組相比，miRNA-31-5p 激動劑組、pcDNA3.1 組細胞SATB2、Vimentin的表達明顯降低，E-cadherin的表達明顯升高，與miRNA-31-5p 激動劑組相比，pcDNA3.1 組細胞SATB2、Vimentin的表達明顯升高，E-cadherin的表達明顯降低，差異均具有統計學意義（P<0.05，圖3C）。

2.4 miRNA-31-5p 靶向SATB2 調控MDA-MB-231細胞的體內生長與轉移

裸鼠皮下種植乳腺癌模型結果顯示，與正常組相比，miRNA-31-5p-agomir 組、pcDNA3.1 組的瘤體質量以及病灶轉移的比例明顯降低，與miRNA-31-5pagomir 組相比，pcDNA3.1 組的瘤體質量以及病灶轉移的比例明顯升高，差異均具有統計學意義（均P<0.05，圖4A～B）；Western blot 結果顯示，與正常組相比，miRNA-31-5p-agomir 組、pcDNA3.1 組瘤體內SATB2、Vimentin的表達明顯降低，E-cadherin的表達明顯升高，與miRNA-31-5p-agomir組相比，pcDNA3.1組瘤體內SATB2、Vimentin的表達明顯升高，E-cadherin的表達明顯降低，差異均具有統計學意義（均P<0.05，圖4C）。

3 討論

盡管乳腺癌的診斷、治療以及預后均有較為明顯的進步，但該病的長期生存率仍未令人滿意。因此，揭示乳腺癌細胞增殖和轉移的分子途徑，尋找可靠的治療靶點，是亟需解決的挑戰之一。

miRNAs 調控癌細胞的增殖、凋亡、侵襲與轉移等生理過程。研究顯示， miRNA-31-5p在結腸癌、鼻咽癌、膀胱癌等惡性腫瘤中的表達異常，并影響患者預后[6]。Chen 等[7]研究顯示，在肝癌組織中，過表達miRNA-31-5p 后，癌細胞的增殖與侵襲能力隨之下降。Zhao 等[8]研究顯示，升高miRNA-31-5p在前列腺癌細胞系中的表達后，腫瘤細胞的體內生長與轉移能力明顯下降。曾國棟等[9]研究顯示，miRNA-31-5p在乳腺癌組織中的表達降低，升高miRNA-31-5p的表達能明顯調控腫瘤細胞上皮間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）、E-cadherin和Vimentin的表達，但未揭示miRNA-31-5 與乳腺癌細胞的增殖與轉移的分子調控機制。本研究結果顯示，miRNA-31-5p在乳腺癌細胞系MCF-7、MDA-MB-468、MDAMB-231、MDA-MB-453、4T1、HCC1937 中的表達明顯降低，過表達miRNA-31-5p 后，MDA-MB-231 細胞的體外增殖與轉移，體內生長與轉移能力明顯下降，這些結果顯示了miRNA-31-5p 作為治療乳腺癌靶點的良好前景。

SATB2的基因能編碼733 個氨基酸，定位于2號染色體上，物種的進化上高度保守。研究顯示，SATB2 能與核基質緊密結合區的序列進行特異性結合，直接幫助腫瘤細胞進行轉移和免疫逃逸[10]。SATB2在結腸癌、肺癌、口腔鱗狀細胞癌等腫瘤中表達異常，參與調控腫瘤細胞的增殖、分化、運動、衰老等生物學過程[11]。Roy 等[12]研究指出，SATB2在結腸癌、鼻咽癌、膠質瘤等多種腫瘤中表達升高，誘導癌細胞EMT，成為實體惡性腫瘤治療的靶點。Wang 等[13]研究顯示，沉默SATB2在肝癌的表達后，能明顯抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，并逆轉腫瘤細胞的EMT。本研究中qRT-PCR 結果顯示，SATB2在乳腺癌組織和乳腺癌細胞系的表達均明顯升高，在MDA-MB-231 細胞中的表達升高尤為明顯；雙熒光素酶實驗結果顯示，miRNA-31-5p 能靶向調控SATB2 表達，轉染pcDN A3.1-SATB2 可部分逆轉miRNA-31-5p 對MDA-MB-231 細胞增殖和轉移的抑制作用。

綜上所述，在乳腺癌中miRNA-31-5p 表達降低，SATB2 表達升高，過表達miRNA-31-5p 后能明顯抑制MDA-MB-231 細胞的體外增殖與轉移以及體內生長與轉移能力，但轉染pcDNA3.1-SATB2 可部分逆轉這一抑制作用。但如何將兩者的靶向作用制備成可實用的技術探針在乳腺癌的診斷與治療中發揮作用，還需要更為系統、更多學科的綜合研究。