鼠傷寒沙門菌BaeSR對氟喹諾酮類藥物耐藥性的調控機制

張 臨，盧 芳，付恒峰，姜西迪，魏祺靈，漆彩麗，高海俠，李 琳

(安徽農業大學動物科技學院，合肥 230036)

沙門菌(Salmonella)作為公共衛生學領域重要的人獸共患病原菌之一，廣泛存在于自然界中，通過污染食物、水源等致人獸食物中毒和感染性腹瀉[1-2]。沙門菌是導致我國人獸食源性細菌中毒的首要致病菌[3]，目前已發現超過2 600種血清型[4]，每年可造成全球至少9 300萬人感染[5]。氟喹諾酮類(FQs)藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強、交叉耐藥率低等優點，被認為是防治沙門菌感染的首選抗菌藥物之一[6]。然而隨著臨床上濫用抗菌藥物以及耐藥基因的水平轉移，沙門菌多重耐藥現象日益嚴重，威脅到畜牧養殖業的生產和公共衛生健康，因此研究沙門菌的耐藥機制，尋找抗菌藥物新靶點，成為亟待解決的問題。

雙組分系統(two component system，TCS)是細菌感應、傳導外界信號，調節多種生命活動的基因表達調控系統[7]。BaeSR由組氨酸蛋白激酶感受元件BaeS和應答調控元件BaeR組成[8]，在環境壓力下，活化的BaeS導致BaeR磷酸化，從而激活靶基因轉錄，達到調控細菌耐藥性或毒力的目的。BaeSR是鼠傷寒沙門菌中重要的雙組分系統，最初在大腸桿菌中發現[9]，與細菌毒力、耐藥性密切相關。有研究表明，BaeSR可通過上調多重耐藥泵 AcrD和 MdtABC的表達量來調控沙門菌的多重耐藥[10]。BaeR通過降低大腸桿菌acrB缺失株外膜蛋白的表達水平來降低菌株對頭孢菌素的敏感性[11]。目前有很多關于BaeSR對細菌耐藥性調控機制的研究，然而BaeSR對鼠傷寒沙門菌耐藥性調控的分子機制尚未完全清楚，因此擬探索鼠傷寒沙門菌BaeSR對耐藥性的調控機制，尋找BaeR的潛在靶基因，豐富其調控通路。

本實驗室在前期研究中構建了鼠傷寒沙門菌體外誘導環丙沙星耐藥株(CR)，并在CR基礎上成功構建了baeSR和acrB基因雙缺失株(CR△baeSR△acrB)、baeR過表達株(CRpbaeR△baeSR△acrB)及baeR回補株(CRcbaeR△baeSR△acrB)，通過菌株生物學特性測定以及對采用轉錄組學技術篩選與耐藥相關的差異表達基因的分析，發現BaeSR和AcrB外排泵影響耐藥基因的表達。因此，本研究對 BaeR進行表達、純化與驗證，并結合LacZ報告基因融合試驗及凝膠阻滯試驗(EMSA)，旨在尋找BaeR的潛在靶基因，為深入闡明BaeSR對鼠傷寒沙門菌的耐藥調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門菌體外誘導環丙沙星耐藥株CR由本實驗室保存，baeSR和acrB基因雙缺失株(CR△baeSR△acrB)及baeR基因過表達株(CRpbaeR△baeSR△acrB)均由本實驗室構建。

1.2 主要試劑

LB肉湯培養基購自生工生物工程(上海)股份有限公司，質粒小量提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自康寧生命科學(吳江)有限公司，β-半乳糖甘酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司，山羊抗兔IgG H&L(HRP)購自英國Abcam公司。

1.3 BaeR蛋白的表達、純化與驗證

1.3.1 BaeR蛋白的表達 根據NCBI公布的鼠傷寒沙門菌ATCC13311中baeR的基因組序列設計引物(表1)，以CR為模板，進行PCR擴增。使用PCR產物純化試劑盒純化目的基因，用質粒提取試劑盒提取pCold I質粒。將純化后的baeR與pCold I載體進行雙酶切(限制性核酸內切酶為BamHⅠ和HindⅢ)、回收純化與連接，將連接產物命名為pCold I-baeR，并轉入E.coliBL21感受態細胞，提取重組質粒，并送生工生物工程股份有限公司測序。

將轉化后的菌液按1∶100比例接種于LB(Amp50 μg·mL-1/氯霉素20 μg·mL-1/Tet5 ng·mL-1)培養基中，37 ℃ 培養至OD600 nm=0.4～0.6。取部分菌液作為未誘導對照，另一部分菌液中加入終濃度為0.1 mmol·L-1IPTG誘導劑，15 ℃ 180 r·min-1誘導24 h，離心收集沉淀，用PBS重懸后超聲破碎，離心，取超聲后的上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測。

1.3.2 BaeR蛋白的純化 取上述收集的蛋白與Ni-binding buffer按照1∶5混合后，上Ni-His resin柱進行親和純化，收集洗脫的目的蛋白，用透析袋除去高濃度的咪唑和鹽，用PBS透析置換洗脫液，最后目的蛋白溶解于PBS中。

1.3.3 Western blot驗證 將純化后的BaeR蛋白進行BCA蛋白濃度測定后再進行SDS-PAGE。將PAGE膠與PVDF膜根據目的蛋白和內參的分子量大小裁剪，并使大小一致。采用濕轉印系統，將膜于300 mA恒流轉印35～40 min。完成后用0.5‰TBST沖洗，4 ℃封閉過夜。孵育一抗：使用封閉液將抗His標簽抗體(Abcam，兔多抗)稀釋至1∶4 000，4 ℃靜止孵育過夜；用TBST 洗滌5次，置于水平搖床上劇烈洗滌3 min·次-1。孵育二抗：使用封閉液將HRP標記二抗(山羊抗兔IgG抗體)稀釋至1∶8 000，常溫孵育1～2 h；洗滌條件同上。最后進行顯色檢測。

1.4 LacZ報告基因融合試驗

采用BPROM 程序預測sodB、tolC、spy、mdtD、ompW和marR基因的啟動子區，設計引物(表1)，進行PCR擴增。反應體系：PrimeSTAR Max DNA polymerase 25 μL，上下游引物(各基因引物見表1)各1 μL，模板2 μL，ddH2O 21 μL，共50 μL。反應程序：95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,62 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。將上述PCR產物與pACYC184-LacZ質粒進行雙酶切。酶切產物進行鑒定、純化與連接，構建重組質粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-mdtD和pACYC184-LacZ-sodB，用引物lacZ-BF/BR進行PCR鑒定(方法同上)。將鑒定后的重組質粒電轉入CR△baeSR△acrB和CRpbaeR△baeSR△acrB中得到LacZ菌株，用引物lacZ-BF/BR進行PCR鑒定(方法同上)后送至生工生物工程股份有限公司進行測序。將測序正確的LacZ菌株培養至OD600nm≈1后，離心收集菌體，超聲破碎，按照β-半乳糖苷酶試劑盒說明書操作，對各菌株進行酶活性檢測。

表1 引物種類和序列

1.5 EMSA

根據LacZ報告基因融合試驗中預測的ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的啟動子區域，設計探針，探針由江蘇凱基生物技術股份有限公司合成，序列見表2。合成帶有生物素標記的雙鏈探針并稀釋。配制6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠，預電泳10 min。探針與純化蛋白進行結合反應，然后依次進行SDS-PAGE、轉膜、紫外交聯與發光檢測。為了驗證EMSA試驗結果的可靠性，同時進行競爭性EMSA試驗。

表2 各探針序列

2 結 果

2.1 BaeR蛋白的表達、純化及驗證

2.1.1baeR基因的PCR擴增結果 經PCR擴增后，得到1條750 bp的條帶(圖1)，符合預期目的片段的大小。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準; 1～4.baeR基因PCR擴增產物

2.1.2 重組質粒pCold I-baeR的檢測 對重組質粒pCold I-baeR及其酶切產物進行10 g·L-1瓊脂糖凝膠得到約750 bp(目的基因)和約4 200 bp(pCold I)的條帶，符合預期目的片段的大小(圖2)。重組質粒測序結果正確，未出現缺失或突變。

M.DL12000 DNA相對分子質量標準; 1.重組質粒pCold I-baeR; 2.pCold I-baeR經BamH I和HindⅢ雙酶切

2.1.3 BaeR蛋白的誘導表達及SDS-PAGE分析 取誘導前對照、誘導后全菌、誘導后上清和誘導后沉淀進行SDS-PAGE分析。誘導后全菌、誘導后上清和誘導后沉淀在28 ku處出現1條特異性條帶，且條帶大小和位置符合預期，誘導前對照未出現該條帶，說明BaeR蛋白成功表達，且在上清和沉淀中均有分布(圖3)。

2.1.4 BaeR蛋白的純化 取上清中的目的蛋白經Ni-His resin柱親和層析，進行SDS-PAGE分析，在28 ku處得到單一、清晰的蛋白條帶，表明成功獲得純化后BaeR蛋白(圖4)。

2.1.5 BaeR蛋白的Western blot驗證 表達的重組蛋白分別用兔多抗和山羊抗兔IgG抗體進行Western blot分析。結果顯示，在28 ku處出現目的條帶(圖5)。

M.蛋白質相對分子質量標準; 1.純化前上清; 2.純化后BaeR; 3.未誘導對照

2.2 LacZ報告基因融合試驗

2.2.1 啟動子區的擴增 根據鼠傷寒沙門菌ATCC13311的基因組序列，設計特異性引物，擴增ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy基因的啟動子區，擴增片段大小分別約為410、360、370、480、440、390 bp(圖6)。

M.DL500 DNA相對分子質量標準; 1.ompW; 2.sodB; 3.tolC; 4.mdtD; 5.marR; 6.spy

2.2.2 重組質粒的構建及轉化 將純化后的基因分別與pACYC184-LacZ質粒進行雙酶切，構建重組質粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-mdtD和pACYC184-LacZ-sodB，用引物lacZ-BF/BR對各基因進行PCR鑒定，片段分別約為790、810、770、840、880、760 bp(圖7)。

M.DL10000 DNA相對分子質量標準; 1.spy; 2.ompW; 3.tolC; 4.marR; 5.mdtD; 6.sodB

2.2.3 LacZ菌株的構建及檢測 通過電轉化法將重組質粒pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-sodB和pACYC184-LacZ-mdtD分別轉入CR △baeSR△acrB與CRpbaeR△baeSR△acrB感受態細胞中，構建LacZ菌株，用引物lacZ-BF/BR進行PCR鑒定，片段分別約為790、770、810、840、760、880 bp(圖8)，測序鑒定結果正確。

M.DL2000 DNA相對分子質量標準; 1、2.spy; 3、4.tolC; 5、6.ompW; 7、8.marR; 9、10.sodB; 11、12.mdtD;1、3、5、7、9、11.CR△baeSR△acrB株; 2、4、6、8、10、12.CRpbaeR△baeSR△acrB株

2.2.4 β-半乳糖苷酶活性檢測 按照β-半乳糖苷酶活性檢測試劑盒說明書操作，檢測各菌株的β-半乳糖苷酶活性，由圖9可知，與雙缺失株CR△baeSR△acrB相比，過表達株CRpbaeR△baeSR△acrB的LacZ菌株的β-半乳糖苷酶活性極顯著升高(P<0.01)，表明baeR對spy、tolC、ompW、marR、sodB和mdtD具有正調控作用。

通過檢測各菌株的β-半乳糖苷酶活性評估baeR基因過表達對 pACYC184-LacZ-spy、pACYC184-LacZ-tolC、pACYC184-LacZ-ompW、pACYC184-LacZ-marR、pACYC184-LacZ-sodB 和pACYC184-LacZ-mdtD的影響；**表示與CR△baeSR△acrB相比差異極顯著(P<0.01)

2.3 EMSA結果

2.3.1 BaeR蛋白可以調控marR基因的表達 為了尋找BaeR調控的靶基因，根據預測到的ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的啟動子區域，設計含有生物素標記的探針，探明BaeR蛋白能否與生物素標記探針的DNA片段結合。根據遷移快慢情況分析，BaeR蛋白與marR有明顯結合的遷移阻滯條帶，與ompW、mdtD、tolC、sodB和spy無明顯結合的遷移阻滯條帶(圖10)。結果表明：BaeR蛋白可以直接調控marR基因的表達，間接調控ompW、mdtD、tolC、sodB和spy的表達。

1.mdtD探針; 2.mdtD探針+BaeR蛋白; 3.ompW探針; 4.ompW探針+BaeR蛋白; 5.tolC探針; 6.tolC探針+BaeR蛋白; 7、14.對照; 8.marR探針; 9.marR探針+BaeR蛋白; 10.spy探針; 11.spy探針+BaeR蛋白; 12.sodB探針; 13.sodB探針+BaeR蛋白

2.3.2 競爭性EMSA 為了驗證EMSA結果的可靠性以及蛋白與非競爭性探針的結合情況，將試驗中可以與蛋白結合的探針marR，設計了不加生物素標記的競爭性探針，試驗結果表明，隨著非競爭性探針濃度的增加，結合的遷移阻滯條帶越明顯。當競爭性探針為50倍時，僅僅競爭掉部分標記探針，當競爭性探針為100倍時，可以競爭掉全部的標記探針(圖11)。

1.對照; 2.1 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 3.2 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 4.4 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 5.8 μmol·L-1 marR探針+BaeR蛋白; 6.50倍競爭性探針+ marR標記探針+BaeR蛋白; 7.100倍競爭性探針+ marR標記探針+BaeR蛋白

3 討 論

沙門菌是常見的食源性致病菌之一[12]，通過多種途徑直接或間接感染人和動物[13]，臨床常用FQs防治沙門菌病。近年來，由于FQs的不合理使用，臨床耐藥菌株快速增長，耐藥機制主要包括靶點突變、質粒轉移、外排泵過表達、細胞膜通透性改變及生物膜的形成等，這些機制常協同發揮作用。在實驗室前期研究中發現，在鼠傷寒沙門菌中，BaeSR和AcrB外排泵與菌株對FQs的耐藥性密切相關且BaeR過表達后可通過調節外排泵、生物膜和鞭毛等相關基因的表達來影響細菌的耐藥性。為闡明鼠傷寒沙門菌的耐藥調控機制，本研究進一步探索BaeR對潛在靶基因的調控作用。

自1969年首次分離到LacZ報告基因后，該基因被廣泛用于基因表達調控的研究之中[14]。LacZ報告基因的表達產物是β-半乳糖苷酶，該酶存在于多種生物體內，是由4條相同肽鏈構成的四聚體，具有高生產率和低成本的優點[15]，常用于啟動子的篩選、驗證或效能測定中[16]，它可將鄰硝基苯基-β-半乳糖苷(ONPG)水解為半乳糖和黃色的鄰硝基苯酚[17-18]，因為后者的產生量與β-半乳糖苷酶的濃度成正比，所以可以通過黃色產生量間接確定LacZ表達水平。通過分光光度計(A420nm)的黃色出現率可以測量酶活性[19]。仇越等[20]研究發現，副溶血弧菌aphA缺失株的β-半乳糖苷酶活性顯著低于野生株，表明AphA可正向調控exsA和exsD的轉錄表達。EMSA是體外檢測RNA與特定目標蛋白結合的有效方法[21]，具有高靈敏度、高分辨率以及快速準確等諸多優點，被廣泛應用于細菌轉錄調控研究[22]。Yu等[23]通過EMSA證明BasR可以直接與emrD啟動子結合激活其轉錄表達，降低了大腸桿菌對多種抗菌劑的敏感性。此外，Yu等[24]還指出McbR可以結合到acrAB、acrD、acrR、emrD和mdtD的啟動子區，直接激活這些外排泵基因的轉錄從而在細菌耐藥性調節中起重要作用。為了探究BaeSR在沙門菌耐藥性中發揮的作用，作者進行BaeR蛋白的表達與純化，并應用LacZ報告基因融合技術和EMSA去尋找BaeR調控的潛在靶基因。從轉錄組篩選到的耐藥相關基因中，選取外膜蛋白相關基因ompW、tolC，生物膜相關基因sodB、spy，外排泵相關基因mdtD和marR作為BaeR的潛在靶基因。研究發現在鼠傷寒沙門菌baeR過表達株中，ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy的β-半乳糖苷酶活性明顯高于雙缺失株。這表明BaeR可以正向調控ompW、sodB、tolC、mdtD、marR和spy的表達。BaeR可以結合到marR的啟動子區，直接調控其表達，不能或間接調控ompW、sodB、tolC、mdtD和spy的表達。

革蘭陰性菌存在一層阻礙外界有毒化學物質滲入胞內的外膜屏障，孔蛋白是與細菌滲透性和抗生素耐藥性調節息息相關的外膜蛋白。BaeR過表達使外膜通道tolC基因表達增加，這是MdtABC和AcrD多藥輸出系統功能所必需的[25]。阪崎腸桿菌ompW缺失株受硫酸新霉素的脅迫后，生物膜形成能力顯著增強[26]，提示外膜蛋白OmpW可能與氨基糖苷類抗生素耐藥性有關。sodB基因的缺失會增強細菌的生物膜形成能力[27]。外排泵與細菌多重耐藥性密切相關，本試驗篩選的外排泵相關基因主要有marR、mdtD與spy。mdtD屬于MFS超家族轉運蛋白，是MdtABCD-baeSR操縱子的一部分，受到baeR的調控[28]。Spy是一種小周質蛋白，spy啟動子上游具有BaeR結合位點，BaeR可以直接與spy的啟動子區結合調控其表達。當baeR基因缺失后，spy的表達量下降[29]。MarR是一種阻遏因子，屬于marRAB操縱子，與MarO結合后抑制自身及構成操縱子的其它基因表達來阻礙marRAB操縱子的轉錄。MarA和MarR同屬marRAB操縱子，MarA是一種全局調控蛋白，胞內水平受MarR調控，高水平的MarA可以與AcrAB基因上游的marbox結合并激活其轉錄，同時也可與TolC附近特異性DNA結合位點結合，上調TolC的表達量，從而引起細菌對抗生素耐藥[30-31]。沙門菌中，marR基因突變與FQs耐藥性及Mar表型相關[32]。在本試驗中，BaeR可以直接與marR的啟動子區結合并調控其表達，由此推測BaeR與marR結合后使marR與marO結合體解離，從而激活MarRAB轉錄，MarA表達量上升，導致細菌耐藥性增強，這一發現為沙門菌耐藥調控機制的研究奠定了基礎，為藥物靶點的開發提供了思路。

4 結 論

成功表達BaeR蛋白，同時對LacZ報告基因融合試驗及EMSA的結果進行分析，發現BaeR可正向調控ompW、mdtD、tolC、sodB、spy和marR的表達，并直接調控marR的表達，表明BaeSR可能通過調控這些靶基因的表達來影響鼠傷寒沙門菌對FQs的耐藥性，為深入闡明BaeSR對鼠傷寒沙門菌的耐藥調控機制提供理論依據。