靶向cofilin2基因RNAi對鴨病毒性腸炎病毒增殖的影響

王 微，華 敏，張 蕓，李 濤，張黔東，袁 陽，程振濤，4，文 明，4*

(1.貴州大學動物科學學院，貴陽 550025；2.貴州省畜禽遺傳資源管理站，貴陽550025；3.貴州省動物預防控制中心，貴陽550025；4.貴州省動物生物制品工程技術研究中心，貴陽 550025)

鴨瘟病毒(duck plague virus，DPV)又稱為鴨病毒性腸炎病毒(duck enteritis virus，DEV)，屬皰疹病毒科成員。DEV傳播速度快且病死率較高，常引起鴨、鵝等禽類發生急性、敗血性、高度接觸性傳染病，造成了養殖戶嚴重的經濟損失。病禽往往表現為精神不振，綠色稀糞，頭部腫脹，兩腳麻痹不能站立；其病變特征為組織、消化道出血壞死，血管損傷，淋巴器官特異性病變和實質性臟器退行性病變。

絲切蛋白(cofilin)是肌動蛋白解聚因子(actin depolymerizing factor，ADF)/cofilin家族的一員，在哺乳動物神經元中主要通過切斷或穩定肌動蛋白絲以影響肌動蛋白組裝的動力學[1]。病原微生物進入宿主細胞并在細胞內轉運需要肌動蛋白細胞骨架，cofilin與細胞骨架的正常結構、動力學和功能有關，因此對病原微生物進入宿主細胞有著重要的影響[2-3]。cofilin蛋白有2種：cofilin1和cofilin2[4]。cofilin1在細胞遷移、增殖和噬菌體形成中起作用；cofilin1以及cofilin2在病毒復制過程中表達方式不同[5-7]。cofilin2主要是在真核細胞中表達，它結合并解聚肌動蛋白絲來對細胞的生理功能進行調節，其在細胞中的活性受磷酸化、去磷酸化和pH的調節[8]。cofilin2在肌肉發育和功能作用尚不清楚，但可能參與了肌纖維發生過程中肌動蛋白組裝的調節和成熟肌肉中的肌動蛋白動力學[9]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是由正義RNA和反義RNA組成高度保守的小型雙鏈RNA(double-stranded RNA，dsRNA)導入細胞中誘發的基因沉默現象，dsRNA分為miRNA(micro RNA)，siRNA(small interfering RNA，siRNA)和shRNA(short hairpin RNA，shRNA)[10-11]。shRNA是一種具有發夾環的人工RNA分子，可克隆成表達載體，在宿主細胞中RNA聚合酶作用下導致較長時間的基因沉默[12-14]。此外，由于它們發夾結構有穩定基因表達的潛力，它們有利于體內研究，是一種實用工具[15-16]。盡管近年來對DEV的研究進展為病毒發病的基本機制提供了新的認識，但有關RNAi 干擾cofilin2基因對DEV增殖的影響研究鮮有報道。研究cofilin2基因對DEV在宿主細胞內增殖過程的影響，對DEV的研究致病機理以及疾病防控具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、載體及細胞 DEV-GZ株及DEF由本實驗室提供；pGPH1/GFP/Neo表達載體及shRNA質粒購自吉瑪生物有限公司；感受態細胞大腸桿菌DH5α菌株購自天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司；胰蛋白酶及DMEM購自Nalgen公司；FBS購自賽默飛世爾科技公司；Prime ScriptTMRT Master Mix、SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ購自TaKaRa公司；UNIQ-10無內毒素質粒DNA小量提取試劑盒購自OMEGA公司，其他試驗所需試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 shRNA干擾載體序列設計 通過Ambion在線軟件設計篩選鴨源cofilin2全基因序列(MF434775)中4條特異性shRNA序列，并加入5′-TTCAAGAGA-3′序列形成發夾結構。4條shRNA序列中靶序列起始位置分別為460～480、313～333、256～276、95～115，根據靶序列起始位置不同將shRNA干擾載體分別命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86；設計1條陰性對照并命名為shRNA-NC，靶序列及shRNA序列詳見表1。

表1 cofilin2基因shRNA序列

1.2.2 shRNA干擾載體構建 oligo混合物制備(正義鏈、反義鏈各5 μL，10×oligo annealing buffer 2 μL，ddH2O補足20 μL)；將制備好的oligo混合物95 ℃加熱5 min，冷卻放置一段時間使其形成DNA雙鏈并稀釋至10 nmol·L-1待用。分別按照5×ligation buffer 4 μL、ds oligo 4 μL、pGPH1/GFP/Neo 2 μL、T4 DNA ligase(1 U·μL-1)1 U的順序逐步加入，ddH2O補足20 μL；室溫條件下放置30 min(使質粒能夠充分轉化到DH5α感受態細胞中)。將制備好的shRNA載體涂布于含有奇霉素的LB固體培養基中，37 ℃恒溫培養24 h以篩選出轉化成功的DH5α感受態細胞，挑取平板上的單個菌落于LB肉湯中，180 r·min-137 ℃恒溫搖床中增菌12 h后，離心收集菌體。提取質粒中的DNA送生工生物工程(上海)公司測序，分析shRNA干擾載體是否構建成功。

1.2.3 細胞培養與轉染 DEF制備：受精鴨蛋孵化至10日齡，取胚體的軀干剪碎加入胰蛋白酶吹打離心，棄掉上清，轉入3 mL DMEM培養基中吹打，用過濾器過濾并收集細胞液，轉入含雙抗+10% FBS的生長培養基中，放入5%CO2培養箱中37 ℃培養至細胞長滿瓶底。shRNA及Lipofectamin? 3000(1∶1)各125 μL混勻，室溫放置5 min后，緩慢將Lipofectamine? 3000-shRNA復合物加入到已經轉入生長良好的DEF六孔板中，將六孔板放置于5%CO2培養箱37 ℃孵育。

1.2.4 shRNA干擾載體的篩選 將cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86及shRNA-NC 5個干擾載體，按“1.2.3”方法轉染到DEF中。經轉染24 h后放置于熒光顯微鏡上觀察重組質粒中GFP基因是否出現綠色熒光蛋白表達。確定細胞生長良好及GFP正常表達后，經熒光定量PCR檢測4對shRNA干擾效果并進行shRNA的篩選，FQ-PCR反應體系: SYBR premix Ex Taq Ⅱ(Til RNaseH Plus)(2×)5.0 μL，PCR 上、下游引物各0.5 μL, DNA模板1.0 μL, 加ddH2O至10 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s、55 ℃退火30 s，共循環40次；在退火時采集5 s熒光，采集熔解曲線，溫度范圍為60～95 ℃，溫度臺階為0.5 ℃。

2 結 果

2.1 重組質粒shRNA的構建

靶向設計shRNA序列插入到載體中，通過Sanger測序比對結果顯示，由于shRNA序列中靶序列起始位置不同，分別將shRNA干擾載體命名為cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86，測序結果見表2，shRNA干擾質粒構建成功。

表2 shRNA質粒測序

2.2 shRNA序列篩選

應用EXCEL軟件對shRNA序列篩選。

2.2.1 shRNA干擾質粒篩選熒光表達結果 轉染24 h于普通顯微鏡觀察shRNA干擾質粒，其在DEF中生長良好；經24 h培養后重組質粒載體中GFP基因顯示綠色熒光蛋白熒光(圖1)，DMEM中未見綠色熒光蛋白熒光，說明DMEM不表達，重組質粒中GFP基因表達轉染重組質粒成功。

A.轉染shRNA質粒DEF生長情況圖；B.轉染24 h后shRNA質粒熒光圖

2.2.2 shRNA篩選FQ-PCRcofilin2核酸含量檢測結果 通過FQ-PCR檢測篩選mRNA水平shRNA的干擾效果，轉染重組質粒cofilin2-451、cofilin2-304、cofilin2-247、cofilin2-86后DEF中cofilin2轉錄量，均顯著低于對照組(P<0.05)，沉默效率分別為4.96%±0.78%、41.12%±2.94%、17.55%±2.07%、54.02%±1.73%；而陰性對照為4.52%±0.99%，試驗結果發現cofilin2-86干擾組中干擾效果最好，選擇其作為后續試驗使用，shRNA篩選FQ-PCR檢測結果見圖2。

*.P<0.05

2.3 cofilin2-86干擾下DEV增殖動態

六孔板中轉染cofilin2-86的DEF生長至適宜密度時，于48、72、96、120 h 4個時間段收集細胞，cofilin2-86在轉染后4個時間段的干擾效率分別為50.42%±2.02%、56.24%±1.94%、55.34%±0.98%、42.59%±4.32%(圖3)。通過FQ-PCR檢測DEV-GZ株處理DEF后不同時間段收集的細胞液中DEV核酸表達量，cofilin2 shRNA+DEV試驗組顯著低于DMEM+DEV組(P<0.05)(圖4)。DMEM+DEV組中DEV核酸量隨著時間增加而增加，DMEM中的DEV未見表達，cofilin2 shRNA+DEV組中DEV隨時間增加而增加，但明顯低于與DMEM+DEV中的DEV核酸量，說明沉默cofilin2導致DEV核酸復制被抑制，cofilin2可能促進DEV的復制，這與Li等[17]研究的cofilin2具有免疫性和促進細胞增殖作用相一致。

圖3 cofilin2-86轉染不同時間的表達情況

與DMEM+DEV組相比，*.P<0.05

3 討 論

在任何生物調節過程中，轉錄調控都是至關重要的部分，RNAi技術能夠廣泛應用于傳染性、腫瘤性疾病治療，是因為能克隆到shRNA表達載體中以穩定靶基因和干擾目的基因表達。RNAi的作用機制是通過在細胞內導入dsRNA，dsRNA能夠特異性地與細胞內互補的mRNA結合使其降解，以阻止mRNA編碼蛋白質，從而使細胞中目的基因的表達量減少[18-20]。大多數無法轉染的細胞、腺病毒和逆轉錄病毒，可利用RNAi中短發卡結構的shRNA克隆到載體再進行轉染[21]。復制腺病毒作為shRNA的傳遞載體可增強抗腫瘤效果[22]。RNAi技術面臨的主要問題就是脫靶效應，通過設計無法進行化學修飾表達的shRNA可有效降低脫靶效應發生[23-24]。shRNA主要存在的問題是轉染效率，由于不完全的轉染產生不完整的mRNA，可能影響了蛋白的功能[25]。研究運用RNAi技術針對cofilin2設計的4段shRNA片段進行細胞轉染，以期篩選穩定沉默cofilin2基因的靶序列。結合轉染干擾質粒結果，在今后的DEV研究中，采用干擾效率高且穩定性好的cofilin2-86質粒作為載體更合理。

cofilin2的缺乏可能導致肌動蛋白表達降低，也可以改變細胞功能，在細胞內積累導致腫瘤發生[26]。已被證明與肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，這可能與cofilin2在調節細胞周期調節和凋亡中有絲分裂紡錘體形成過程有關[27]。Yu等[28]研究利用cofilin2-shRAN干擾載體轉染到移植腫瘤的裸鼠模型中可有效表達，cofilin2基因沉默抑制了腫瘤生長，表明cofilin2可作為鼻咽癌的潛在治療靶點。Gao等[29]研究在腫瘤腺病毒中shRNA與黏附斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)結合形成FAK-shRNA復合物，轉染細胞后顯著抑制了FAK的表達，并有效抑制了肝癌細胞的生長且對正常細胞無影響。證明RNAi在疾病治療中對癌癥和病毒感染效果顯著，研究cofilin2對探究病毒復制具有重要的意義。本研究將cofilin2-86作為載體轉染到DEF中，DEV病毒核酸量隨著時間的推移持續增長，cofilin2基因對DEV的增殖有促進作用，同時，也存在其他基因影響DEV增殖還有待研究。Zhao等[30]研究利用鴨乙型肝炎病毒感染原發性鴨肝細胞蛋白組分析中，在感染細胞過程中存在75個不同蛋白表達靶點，其中,β-actin和膜聯蛋白A2的差異表達，這些蛋白表達差異在病毒感染中存在潛在作用，同樣在DEV復制增殖過程中存在的其他蛋白表達靶點具有重要的研究意義。

4 結 論

通過將沉默cofilin2轉染到DEF中，cofilin2-86在轉染后4個時間段中最佳干擾效率為56.24%±1.94%，利用干擾效率最佳的cofilin2-86轉染到DEF中，在不同時間DEV處理DEF下，DEV核酸量較轉染對照組中的DEV核酸量總體下降，推測cofilin2基因對DEV的增殖存在促進作用，該結果為今后cofilin2對DEV動態轉錄研究奠定了基礎。