蜱攜帶牛丙型肝炎病毒新亞型巢式PCR檢測方法的建立

郭鑾英，王妮娜，李杭遠，紀雨霏，馬 駿，裴明超，邵建偉，劉 全

(佛山科學技術學院生命科學與工程學院，佛山 528000)

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)，是黃病毒科(Flaviviridae)、丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus)的成員，是人患肝炎、肝硬化和肝癌的主要原因之一[1]。HCV慢性感染是一個全球性的健康問題。據估計，全球超過1.84億人感染HCV[2]，每年有300萬～400萬新感染病例。丙型肝炎病毒不僅存在于人類，也存在各種動物中，包括馬[3-4]、嚙齒動物[5]、蝙蝠[6]和非人類靈長類動物[7]。2015年，Baechlein等[8]首次發現HCV可以感染牛，并證實了該病毒為丙型肝炎病毒屬的一個新種——丙型肝炎病毒N(Hepacivirus N，HNV)。因為牛是其特異性宿主，故HNV又被稱為牛丙型肝炎病毒(BovHepV)[2]。截至2020年，BovHepV共分為7個亞型(A～G型)，我國主要流行E和G型[9]。HNV具有強嗜肝性，主要造成牛無癥狀持續性感染，感染時間可長達13個月[10]。

HNV在(我國)牛群中普遍存在，但HNV的檢測方法尚未見報道。在之前的研究中發現，當使用血清學檢測方法時，黃病毒科的病毒間普遍存在交叉反應現象，因此血清學檢測方法可能不適用于HNV的臨床快速診斷。PCR技術已成為多種病毒早期臨床檢測的金標準，而巢式PCR是PCR的優化方法，具有敏感性高、特異性強，重復性好的特點。因此，建立HNV病毒的巢式PCR檢測方法，可有助于HNV病毒在臨床上的快速診斷。

本實驗室前期對采集自牛體表的蜱進行了宏轉錄組高通量測序，經試驗獲取到1株病毒全基因組，基于保守基因NS3、NS5B構建系統發育樹，發現其為HNV新亞型，命名為BovHepV-GDZJ(GenBank登錄號MZ221927)。為了更好地鑒別、監測、防控以及深入研究該新亞型病毒的流行情況，本研究結合蜱樣品中的BovHepV的高通量測序結果，探索并建立了針對該病毒株的巢式PCR檢測方法。經試驗證明，該方法敏感性高、重復性好、特異性強，具有較好的臨床檢測應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 2020年6—10月，在廣東省湛江市牛養殖場采集蜱115只；在揭陽市牛養殖場采集蜱59只；在廣東省佛山市犬身上，采集蜱126只。經形態學和分子生物學鑒定，蜱均為扇頭蜱屬，其中，微小扇頭蜱59只、鐮形扇頭蜱241只。

1.1.2 病毒毒株或病毒核酸 BovHepV-GDZJ、淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、阿龍山病毒(Alongshan virus，ALSV)、廣平病毒(Quang Binh virus)、Lihan蜱病毒(Lihan tick virus，LTV)、發熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV)等病毒毒株或病毒核酸均由本實驗室提供。

1.1.3 主要試劑與儀器 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0、PremixTaq、pMDTM18-T Vector Cloning Kit試劑盒、PrimeScript One Step RT-PCR kit Ver 2(寶日醫生物技術北京有限公司)；TRIzol LS 試劑(賽默飛世爾科技中國有限公司)；TIANprep Mini Plasmid Kit質粒小提試劑盒；組織研磨機(QIAGEN，德國)；超低溫冰箱(海爾DW-40L508)；渦旋混勻器(WIGGENS，德國)；三槽基因擴增儀(Biometra TRIO 48)；經典電泳儀電源(WIX-EP600C)；恒溫金屬浴(上海一恒科技有限公司)；Axygen瓊脂糖凝膠回收試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 蜱樣品RNA的提取 根據MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒說明書，提取蜱樣品RNA。本研究所使用的RNA終濃度約200 ng·μL-1或使用量為1 ng·50 μL-1體系。

1.2.2 BovHepV序列豐度分析 使用軟件Geneious、PUTTY和FileZilla，結合宏轉錄組高通量測序原始數據，對實驗室獲得的BovHepV全基因組進行簡易可視化定量分析。

1.2.3 HNV巢式PCR引物的設計 根據廣東湛江地區的蜱樣品宏轉錄組測序結果，比較BovHepV基因組信息及mRNA表達量；利用生物學軟件Primer Primeier 6、Oligo 7，在病毒mRNA表達量相對高的區域設計巢式PCR引物。引物經NCBI在線功能Primer-BLAST驗證，對蜱傳或蜱攜帶的多種病原體，如無形體、立克次體均無非特異性擴增。引物序列見表1，由廣州天一輝遠生物科技有限公司合成，引物使用濃度均為10 μmol·L-1。

表1 巢式PCR引物

1.2.4 BovHepV巢式PCR檢測方法的建立及優化 以陽性樣品為模板，進行巢式PCR擴增并優化退火溫度。一輪RT-PCR反應體系(10 μL)：滅菌去離子水2.8 μL，2×1 Step Buffer 5 μL，上游及下游引物各0.4 μL，PrimeScript Enzyme 酶0.4 μL，模板1.0 μL。一輪RT-PCR反應條件：50 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，56、57、58、59、60、61 ℃(6個不同溫度)30 s，72 ℃ 1 min 30 s，30個循環；72 ℃ 5 min;4 ℃ 保溫。巢式PCR反應體系(50 μL)：滅菌去離子水18.5 μL、PremixTaq25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。二輪PCR反應條件：98 ℃ 1 min；98 ℃ 30 s，55、56、57、58、59、60、61 ℃(7個不同溫度)30 s，72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 5 min；4 ℃保溫。PCR產物進行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.5 BovHepV-GDZJ株標準品的制備 以陽性樣品的cDNA為模板，上游引物BovHepV-F：5′-AACCACTGCTGCTCGTCTG-3′，下游引物BovHepV-R：5′-ACGCAGTCGCCTTCAGTT-3′進行擴增，擴增終產物大小為2 094 bp。反應體系共50 μL：滅菌去離子水18.5 μL、PremixTaq25.0 μL、上游引物及下游引物各2 μL、模板2.5 μL。反應條件：98 ℃ 1 min;98 ℃ 30 s;59 ℃ 30 s;72 ℃ 90 s，30個循環；72 ℃ 5 min;4 ℃保存。PCR產物通過核酸凝膠電泳、膠回收后連接到pMD18-T載體，轉化到DH5α 感受態細胞，于含氨芐青霉素的培養板37 ℃培養12 h，挑單個菌落擴大培養，經菌液PCR鑒定后，陽性克隆送公司測序。提取質粒，采用分光光度計測定濃度，計算質粒copies數。Copies數=質量濃度(mg·L-1)×6.023×1014/(堿基數×660)。

1.2.6 特異性試驗 用巢式PCR方法檢測蜱攜帶病毒的核酸，包含HNV、LCMV、ALSV、廣平病毒、SFTSV，以滅菌去離子水作為陰性對照，擴增產物用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測或鑒定。

1.2.7 敏感性試驗 10倍梯度稀釋(105～10-1copies·μL-1)的質粒標準品作為模板，滅菌去離子水作為陰性對照，瓊脂糖凝膠電泳驗證檢測一輪PCR產物和二輪PCR產物，統計檢出質粒DNA的最小拷貝數。

1.2.8 重復性試驗 以構建的陽性質粒為模板，進行組內試驗和組間試驗。組內試驗，取3個不同濃度梯度(105～103copies·μL-1)的BovHepV質粒標準品作為重復性試驗的檢測對象，每個梯度重復3次；組間試驗，以質粒標準品為模板，每間隔1周做1次BovHepV的巢式PCR檢測試驗，連續3周。比較組內、組間試驗的檢測結果，評估該方法的可重復性。

1.2.9 蜱樣品檢測 采用PCR方法和巢式PCR方法，對2020年在廣東地區采集的蜱樣品進行檢測，疑似陽性條帶的PCR產物均經測序方法驗證，比較并分析兩種檢測方法的檢測效率。

2 結 果

2.1 BovHepV-GDZJ序列豐度分析

蜱樣本宏轉錄組測序數據中，BovHepV-GDZJ株全基因組序列的可視化定量分布見圖1。以BovHepV-GDZJ的全基因組序列為內參序列，樣品高通量測序結果共有224個reads定向到該內參序列上，獲得了92.1%的基因組覆蓋率(8 115 nt/8 808 nt，兩兩相似性為99.7%。病毒reads占非核糖體reads總數的百分比為0.003 8%(224 reads/5 883 446 reads)。其中，BovHepV-GDZJ株基因組序列上的1 743―2 665、3 833―4 205、7 877―8 622位區域序列豐度較高，在高豐度區域設計本研究巢式PCR引物。

圖1 廣東湛江BovHepV-GDZJ基因組高通量測序拼接圖

2.2 巢式PCR檢測方法的優化

以陽性樣品RNA為模板，通過調整不同的退火溫度，篩選最適退火溫度，結果如圖2所示。6個退火溫度均能產生與預期大小相符的目的條帶，其中58 ℃溫度條帶最清晰且無明顯雜帶或拖帶。將二輪PCR退火溫度設為55、56、57、58、59、60、61 ℃，結果顯示7個退火溫度均能產生目的條帶，其中第二輪退火溫度最適為56～57 ℃。

M.DNA相對分子質量標準；1.55 ℃；2～7.56～61 ℃；8.陰性對照

2.3 標準品的制備

將BovHepV目的基因克隆至pMD18-T載體。經PCR擴增驗證，目的片段為2 094 bp，與預期大小一致。后將質粒送往測序，確定成功構建標準質粒。超微量分光光度計測得重組質粒濃度為276.70 ng·μL-1，根據公式計算得知，標準品的濃度為6.86×1010copies·μL-1。

2.4 特異性、敏感性及重復性檢驗

特異性試驗結果顯示，此方法僅能擴增BovHepV-GDZJ質粒標準品，對其他病原無反應，表明該巢式PCR方法的特異性較好。

敏感性試驗結果顯示，一輪PCR的檢測下限為6.8×103copies·μL-1(圖3A)。巢式PCR檢測下限為6.8 copies·μL-1，結果表明，本方法具有較高的敏感性，巢式PCR比一輪PCR敏感性高1 000倍(圖3B)。

M.DNA相對分子質量標準；1～7.105～10-1；8.陰性對照

組間及組內試驗均能出現單一目的條帶，表明本方法具有良好的重復性。

2.5 蜱樣品檢測

采用PCR和巢式PCR方法分別檢測300份蜱樣中HNV的流行情況。檢測結果經基因測序方法驗證，揭陽市和佛山市的蜱樣中均未檢測到BovHepV-GDZJ，而湛江市蜱樣中，PCR檢測的陽性率為33.04%(38/115)，巢式PCR檢測的陽性率為46.09%(53/115)。結果說明巢式PCR靈敏性明顯優于PCR。

3 討 論

HNV會造成牛無癥狀持續性感染[8]，對養牛業的健康發展構成了潛在威脅。同時，我國在商品化的胎牛血清中也檢測出HNV核酸[9]，揭示HNV可能對細胞培養等科研試驗及疫苗制備造成不利影響。HNV在全球廣泛分布流行，但關于HNV的傳播方式、傳播途徑、流行情況及早期快速檢測方法均存在較大研究空間。

目前，HCV的檢測方法有血清學方法和分子學方法[11]。血清學方法包括重組免疫印跡試驗和酶聯免疫吸附試驗。分子學方法有直接測序、特異性引物PCR法、特異性探針雜交法等，一部分丙型肝炎病毒是通過高通量測序方法發現的。目前，國內外對HNV的發現及研究都是基于高通量測序技術和PCR方法，還未有系統的分子學或血清學檢測方法，HNV的鑒定及檢測采用何種方法，主要取決于實驗室的現有條件及目的。對臨床而言，能確定病毒基因型、評估牛丙型肝炎病毒在動物種群中受感染的比率及感染既往史，血清學調查可以提供比核酸檢測更真實的結果；對于流行病學研究而言，準確定位到病毒亞型的檢測試驗也是必需的。

此外，本研究結果提示，蜱很可能是HNV機械性傳播媒介而不是自然宿主。與澳大利亞一項關于蜱中發現嚙齒動物肝炎病毒的研究類似[12]，BovHepV-GDZJ在蜱高通量數據集中表現出極低的豐度(0.003 8%)，加上HNV在黃病毒科系統發育中的位置，表明該病毒很可能來自蜱的脊椎動物宿主，并且主要存在于飽血蜱的血液中，而不是來自蜱本身，也可能不感染蜱或在蜱中進行復制。本研究的蜱存在BovHepV高陽性率是因為本次檢測的蜱樣品采集自同一個牛養殖場，不具有統計學意義。后續可重點關注飽血蜱及未吸血蜱攜帶HNV的流行情況、進行湛江市牛場甚至廣東地區牛場BovHepV流行病情況的大規模調查。

4 結 論

基于宏轉錄組學高通量測序方法，首次在廣東湛江市采集的蜱中發現BovHepV-GDZJ并建立敏感性高、特異性強、穩定性好的巢式PCR檢測方法，揭示了蜱攜帶新型病毒的能力，建立的檢測方法也可為后續該病毒株的診斷及防控提供技術支持，為HNV流行病學監測奠定基礎。