高效液相色譜法同時(shí)檢測油脂類藥用輔料中膽甾醇、豆甾醇和β-谷甾醇的含量

尹君，胡鵬輝，舒暢*（1.中國藥科大學(xué)藥物質(zhì)量與安全預(yù)警教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210009；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，南京 211198）

《中國藥典》自1953年開始收載脂肪與脂肪油等油脂類藥用輔料的分析方法，2020年版《中國藥典》四部亦收載了油脂類藥用輔料的分析方法，包括相對密度、折光率、皂化值、雜質(zhì)、水分與揮發(fā)物等的分析檢測，但是對于這些油脂類藥用輔料的甾醇、脂肪酸、

ω

-3 脂肪酸的組成和分類等分析方法尚未收載。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了200多種甾醇化合物，一般存在于復(fù)雜的生物基體中，含量很低，常見的甾醇化合物有膽甾醇、豆甾醇、

β

-谷甾醇、麥角甾醇等，甾醇化合物具有抗腫瘤、消炎、降低心臟疾病風(fēng)險(xiǎn)等生理功能。1999年FDA 批準(zhǔn)了植物甾醇及其酯類使用“健康聲稱”標(biāo)簽，2004年歐盟批準(zhǔn)在特定食品中使用植物甾醇，2010年我國衛(wèi)生部批準(zhǔn)并認(rèn)證植物甾醇為新資源食品。近年來，甾醇化合物在醫(yī)藥、化工、食品等領(lǐng)域備受關(guān)注，需求量逐年遞增。因此，建立一種快速、簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確度好且成本低的甾醇化合物分析方法，對提高我國藥品與食品的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)具有重要意義。甾醇的檢測方法有很多，包括化學(xué)分析法、色譜法以及聯(lián)用技術(shù)等。化學(xué)分析法主要有毛地黃皂苷法和酶法，只能檢測甾醇的總量；色譜法中，薄層色譜法主要用于甾醇化合物的定性分析，無法達(dá)到準(zhǔn)確定量，且靈敏度和穩(wěn)定性較差；氣相色譜法及氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)樣口和檢測器溫度較高，易使待測組分分解或破壞，而硅烷衍生化技術(shù)操作煩瑣，且檢測成本較高；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)靈敏度高，選擇性強(qiáng)，但是儀器操作及維護(hù)煩瑣，對分析人員要求較高。高效液相色譜法是一種常見的色譜技術(shù)，利用皂化和萃取方式，將甾醇化合物從樣本中分離純化后直接進(jìn)樣分析，具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好，且易于操作，簡便快捷，分析成本較低等優(yōu)點(diǎn)。因此，本文采用高效液相色譜法同時(shí)檢測油脂類藥用輔料大豆油中膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇等甾醇成分的含量。

圖1 3 種甾醇組分的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structural of three phytosterols

1 儀器與試藥

1.1 試藥

膽甾醇（純度＞99.7%）、

β

-谷甾醇（純度＞95.0%）、豆甾醇（純度＞90.0%）（阿拉丁試劑）；甲醇、乙腈和異丙醇（色譜純，美國TEDIA 試劑公司）；氫氧化鉀、乙醇、乙醚、丙酮等試劑（均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室純水儀所制。

1.2 儀器

CPA225D 電子天平（Sartorius，德國）；KH-250DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；HC-2062 高速離心機(jī)（山東百歐醫(yī)療科技有限公司）；WH-3 渦旋儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；Milli-Q 純水儀（美國Merk Millipore）；高效液相色譜儀（美國Agilent），配置高壓二元泵（G1312A）、真空脫氣機(jī)（G1322A）、自動(dòng)進(jìn)樣器（G1367A）、柱溫箱（G1316A）、紫外檢測器（G1314A）和Agilent 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 對照品溶液 分別精密稱取膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇對照品10.0 mg 置于10 mL 棕色量瓶中，用乙腈-甲醇-異丙醇（90∶9∶1，

V/V/V

）混合液（以下簡稱稀釋劑）完全溶解后稀釋至刻度，渦旋混勻，即得各甾醇單體對照品儲(chǔ)備液，4℃避光冷藏備用。分別精密稱取

β

-谷甾醇、豆甾醇、膽甾醇對照品10.0 mg 置于同一10 mL 棕色量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，渦旋混勻，即得甾醇混合對照品儲(chǔ)備液，4 ℃避光冷藏備用。精密量取上述混合對照品儲(chǔ)備液1.0 mL 置于10 mL 棕色量瓶中，用稀釋劑稀釋至刻度，即得甾醇混合對照品溶液，4℃避光冷藏備用。

2.1.2 供試品溶液 稱取氫氧化鉀粉末12 g，用10 mL 水溶解后，乙醇稀釋至100 mL，搖勻備用，即氫氧化鉀乙醇溶液。稱取藥用輔料大豆油5.0 g置于圓底燒瓶中，加氫氧化鉀乙醇溶液50 mL，加熱回流1 h 后，放冷至25℃。將上述溶液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，50 mL 水潤洗圓底燒瓶2 次后，并入分液漏斗。100 mL 乙醚提取3 次后，合并乙醚提取液，用40 mL 水洗滌乙醚提取液3 次。依次用40 mL 的3%氫氧化鉀溶液、水洗滌乙醚層各3 次，直至最后洗液加酚酞指示液2 滴不顯紅色。室溫旋蒸除去乙醚，用丙酮6 mL 溶解殘?jiān)?，于空氣流中揮去丙酮，在105℃干燥至連續(xù)2 次稱重之差不超過0.3 mg。加入稀釋劑 10 mL 溶解不皂化物，用0.45 μm 濾膜過濾，得供試品溶液，4℃避光冷藏備用。

2.2 色譜條件

采用Agilent Inspire PHP（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱，流動(dòng)相為甲醇和水（90∶10，

V/V

），等度洗脫，流速1.0 mL·min，檢測波長210 nm，柱溫 30℃，進(jìn)樣體積20 μL，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4℃。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 分別取空白溶液，膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇單個(gè)對照品溶液和混合對照品溶液適量，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。在該色譜條件下，3 種甾醇組分的出峰順序依次是膽甾醇（25.4 min）、豆甾醇（26.8 min）和

β

-谷甾醇（28.9 min），分離度均大于1.8，達(dá)到完全分離要求。混合對照品溶液中膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的理論塔板數(shù)分別為23 329、22 512 和 24 244，對稱因子均在0.96 ～1.04，無明顯拖尾或前沿現(xiàn)象。

2.3.2 專屬性試驗(yàn) 分別取空白溶液、混合對照品溶液、供試品溶液適量，進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。由圖2 結(jié)果可知，在該色譜條件下，空白溶液和輔料對3 種甾醇測定無明顯干擾，供試品中3 種甾醇組分的出峰順序與對照品溶液保持一致，并且分離度均大于2.6。

圖2 專屬性試驗(yàn)色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of specificity test

2.3.3 線性關(guān)系考察 精密量取對照品儲(chǔ)備液適量，分別置于10 mL 棕色量瓶中，加稀釋劑稀釋至刻度，渦旋混勻，得到一系列質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（1、2、5、10、20 μg·mL）。按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，記錄色譜圖。以色譜峰面積積分值（

Y

）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（

X

，μg·mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見表1。

表1 3 種甾醇組分的線性關(guān)系考察結(jié)果
Tab 1 Linearity regression equation of three phytoterols

化合物回歸方程R2膽甾醇 Y ＝9.218X－2.2140.9999豆甾醇 Y ＝10.79X－1.0870.9999 β-谷甾醇Y ＝7.857X－0.77550.9999

2.3.4 定量限與檢測限 將對照品儲(chǔ)備液加稀釋劑逐級(jí)稀釋后進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比（

S/N

）約為3時(shí)，膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的檢測限分別為0.312、0.331 和0.301 μg·mL；當(dāng)

S/N

約為 10時(shí)，膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的定量限分別為0.983、1.01 和0.997 μg·mL。2.3.5 回收率 精密稱取同一批樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，分別加入80%、100%、120%的混合對照品儲(chǔ)備液制備供試品溶液，每個(gè)濃度平行配制3 份，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算回收率。結(jié)果膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的回收率分別在96.02%～97.58%、96.70%～99.47%、97.34%～100.2%，平均回收率分別為97.66%、98.04%、98.82%（

n

＝3），

RSD

分別為1.7%、1.4%、1.4%。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度良好。2.3.6 精密度和重復(fù)性 精密量取同一混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的峰面積

RSD

分別為0.11%、0.40%和0.46%，表明儀器精密度良好。按照“2.1.2”方法平行制備3 份供試品溶液，進(jìn)樣分析。結(jié)果膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇含量平均值的

RSD

分別為2.7%、0.47%和0.99%，表明方法的重復(fù)性良好。2.3.7 穩(wěn)定性 分別取同一混合對照品溶液和同一供試品溶液，室溫下放置0、4、8、12、24 h，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。結(jié)果混合對照品溶液和供試品溶液中3 種成分峰面積

RSD

均＜2.4%，表明混合對照品溶液和供試品溶液室溫放置24 h穩(wěn)定。

2.4 樣品的測定

隨機(jī)抽取5 批樣品，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，分別記錄3 種甾醇的峰面積，結(jié)果見表3。其中，豆甾醇的含量相對較高。

表3 不同樣品的混合甾醇中 3 種甾醇組分的含量( ＝3，mg·kg)
Tab 3 Content of three phytosterols in different samples ( ＝3，mg·kg)

樣品膽甾醇豆甾醇β-谷甾醇樣品14.341±0.08510.82±0.96 4.312±0.064樣品24.500±0.05513.36±0.06 4.442±0.034樣品35.887±0.05418.36±0.03 6.551±0.064樣品47.202±0.28215.51±0.22 5.463±0.055樣品52.368±0.07813.90±0.08 4.584±0.561

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

分別選擇了Agilent Polaris 5 C-A（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Shimadzu WondaSil CSuperb（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Agilent Inspire PHP（250 mm×4.6 mm，5 μm）3 種色譜柱進(jìn)行分離。結(jié)果顯示，膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇在Agilent Polaris 5 C-A 色譜柱上保留較強(qiáng)，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，出峰時(shí)間較長；Shimadzu WondaSil CSuperb 色譜柱未能實(shí)現(xiàn)3 種甾醇組分的完全分離，峰形較差；在相同的流動(dòng)相下，Agilent Inspire PHP 能夠?qū)崿F(xiàn)3 種甾醇組分的完全分離，且色譜峰峰形對稱，能夠滿足定量分析要求。因此，最終采用Agilent Inspire PHP（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分析。

3.2 波長的選擇

采用全波長法在190 ～400 nm 下分別對膽甾醇、

β

-谷甾醇和豆甾醇進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示3種甾醇組分在210 nm 左右有最強(qiáng)吸收，因此選用210 nm 作為檢測波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)考察了不同比例甲醇和水、不同比例乙腈和水條件下對照品溶液中3 種甾醇組分的色譜峰峰形及分離情況。結(jié)果顯示，使用100%甲醇時(shí)檢測信號(hào)變強(qiáng)，峰形變窄且對稱，但膽甾醇和豆甾醇沒有達(dá)到完全分離狀態(tài)；當(dāng)甲醇和水的比例為90∶10（

V/V

）時(shí)，3 種甾醇組分達(dá)到完全分離，柱效較高，峰形對稱。因此，流動(dòng)相最終選擇甲醇和水（90∶10，

V/V

）。

3.4 柱溫的選擇

本試驗(yàn)考察了柱溫對3 種甾醇組分的分析影響，當(dāng)柱溫為25℃時(shí)，峰形變寬，且保留時(shí)間較長；隨著溫度的增加，保留時(shí)間變短，峰形變窄；當(dāng)溫度升高至35 ℃時(shí)，3 種組分未達(dá)到完全分離，且溫度較高會(huì)影響色譜柱壽命。因此，本試驗(yàn)的柱溫設(shè)定為30℃。

通過優(yōu)化色譜柱類型、流動(dòng)相比例、柱溫、檢測波長等色譜條件，建立了藥物中膽甾醇、豆甾醇和

β

-谷甾醇的HPLC 定量分析方法，具有靈敏度高，簡便快速且穩(wěn)定性好，線性范圍寬，分析成本低，適用于含有上述3 種甾醇組分的藥用輔料、食品、藥品、中藥的定量分析。