LC-MS/MS法同時(shí)評(píng)價(jià)吲達(dá)帕胺對大鼠肝微粒體中6種CYP450酶活性的影響

李耕，杜薇，嚴(yán)菲，曹玲，陳民輝*（.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，南京 009；.廣東省婦幼保健院藥學(xué)部，廣州 50000）

藥物相互作用可能發(fā)生在藥效動(dòng)力學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)的各個(gè)階段，約40%的藥物是因?yàn)轶w內(nèi)代謝數(shù)據(jù)不佳（如誘導(dǎo)或抑制藥物代謝酶等）而退出市場。因此，建立一種簡單、準(zhǔn)確、快速、可靠的方法測定藥物代謝酶CYP450 酶活性尤為重要。CYP450 酶系是由多種同工酶組成的超級(jí)大家族，主要存在于肝臟中，本研究選用咖啡因、咪達(dá)唑侖、右美沙芬、甲苯磺丁脲、奧美拉唑、氯唑沙宗等6 種藥物分別作為CYP1A2、CYP3A4、CYP2D6、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E1 等6 種同工酶的探針底物，高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）同時(shí)檢測這6 種探針底物的濃度，通過其消耗量來反映微粒體中CYP450 酶的活性。

本研究選用吲達(dá)帕胺為模型藥物，使用已建立的方法考察其對CYP450 酶活性的影響，以期為其臨床聯(lián)合用藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。吲達(dá)帕胺作為一種抗高血壓作用的利尿劑，常與血管緊張素Ⅱ受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑或鈣拮抗劑合用治療高血壓，由于其臨床聯(lián)合用藥的普遍性，藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)較大，對藥物相互作用的研究是保證聯(lián)合用藥安全、有效、合理的基礎(chǔ)。筆者查閱了吲達(dá)帕胺代謝相關(guān)的文獻(xiàn)，Sun 等報(bào)道了吲達(dá)帕胺代謝轉(zhuǎn)化的路徑，證明了吲達(dá)帕胺的主要代謝器官為肝臟，主要代謝酶為CYP3A4，其次是CYP2C19 和CYP2C8。Wang 等從基因多態(tài)性角度研究了人群中吲達(dá)帕胺代謝的差異性，發(fā)現(xiàn)了另一可能參與代謝的酶亞型為CYP2C9。Yan 等研究了7 種抗高血壓藥在體外肝微粒體孵育時(shí)對吲達(dá)帕胺生物轉(zhuǎn)化的影響；但這些研究均為CYP450 酶對吲達(dá)帕胺代謝的作用和影響，均未涉及吲達(dá)帕胺對CYP450 酶活性（誘導(dǎo)或抑制）的影響。因此，本研究初步篩查了吲達(dá)帕胺對CYP450 酶亞型的影響，以期為聯(lián)合用藥時(shí)吲達(dá)帕胺對其他合用藥物的潛在影響進(jìn)行預(yù)測和評(píng)估。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Finnigan TSQ Quantum Discovery MAX 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)（美國Thermo 公司）；Eppendorf 5430R 高速冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；－80℃超低溫冰箱（美國Thermo 公司）；XW-80A 旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）。

1.2 試藥

甲苯磺丁脲（批號(hào)：100500-200801）、氯唑沙宗（批號(hào)：100364-201302）、咖啡因（批號(hào)：171215-201009）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；氫溴酸右美沙芬（批號(hào)：6114151012）、奧美拉唑（批號(hào)：6013160301）（江蘇恒瑞醫(yī)藥）；枸櫞酸莫沙必利（批號(hào)：MS-105-150904）、格列吡嗪（批號(hào)：G-120-150626）（江蘇豪森藥業(yè)）；馬來酸咪達(dá)唑侖（D02-20141203，江蘇恩華藥業(yè)）；吲達(dá)帕胺（批號(hào)：150805，天津藥物研究院）；上述對照品或原料藥純度均大于 98.0%。其他試劑均購于默克或Sigma 公司。

大鼠肝微粒體為實(shí)驗(yàn)室自制，通過考馬斯亮藍(lán)法測得微粒體中的蛋白含量為19.5 mg·mL。制備所需的雄性SD 大鼠為SPF 級(jí)，體質(zhì)量為180 ～220 g，由南京市青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2014-0001。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、咖啡因、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲適量，用甲醇溶解稀釋，分別定量制成濃度分別為20、20、40、40 和100 mmol·L的單標(biāo)儲(chǔ)備液。精密稱取奧美拉唑適量，用1 mmol·LNaOH的水溶液-甲醇（1∶1）溶解稀釋，定量制成20 mmol·L的單標(biāo)儲(chǔ)備液。上述6 種儲(chǔ)備液于4℃冷藏保存，臨用時(shí)按需用去離子水稀釋成相應(yīng)濃度的混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液。

分別精密稱取枸櫞酸莫沙必利、格列吡嗪對照品適量，用甲醇溶解并稀釋，定量制成1.0 mg·mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液，于4 ℃冷藏保存，臨用時(shí)按需用甲醇稀釋成相應(yīng)濃度的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2 LC-MS/MS 測定條件

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax Eclipse SB-C（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸＝55∶45（

V

/

V

）； 流速：0.2 mL·min；柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 在電噴霧電離（ESI）條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），4.1 min 時(shí)由正離子檢測切換至負(fù)離子檢測。毛細(xì)管溫度為250℃，鞘氣（N）壓力為25 bar，輔助氣（N）壓力為5 bar，碰撞氣（Ar）壓力為1.5 mTorr，其他質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

表1 6 種底物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件參數(shù)
Tab 1 Parameters of mass spectrometry for 6 substrates and internal standards

化合物名稱電離方式MRM/（m/z）保留時(shí)間/min噴霧電壓/kV碰撞能/eV CYP1A2咖啡因ESI＋195.0 →138.02.3＋3.519 CYP3A4氫溴酸右美沙芬ESI＋272.0 →171.02.8＋3.539 CYP2D6馬來酸咪達(dá)唑侖ESI＋326.0 →291.03.0＋3.524 CYP2C9奧美拉唑ESI＋346.0 →198.03.4＋3.521內(nèi)標(biāo)枸櫞酸莫沙必利ESI＋422.0 →198.02.4＋3.521 CYP2C19氯唑沙宗ESI－168.0 →132.05.1－3.022 CYP2E1甲苯磺丁脲ESI－269.0 →170.06.8－3.027內(nèi)標(biāo)格列吡嗪ESI－444.1 →319.09.2－3.020酶

2.3 樣品處理

取孵育體系樣品200 μL，置1.5 mL 高速離心管中，精密加入混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液200 μL，加入甲醇600 μL，渦旋2 min 混勻，16 000 r·min，4℃離心10 min，取上清液，在16 000 r·min，4℃離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液，供LC-MS/MS 分析。

2.4 孵育實(shí)驗(yàn)

微粒體孵育體系的總體積為200 μL，包括肝微粒體蛋白（0.2 ～2 mg·mL），0.1 mol·LPBS 緩沖液，10 mmol·LMgCl，混合探針?biāo)幬铮Х纫?、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲濃度分別為16、8、8、8、32 和40 μmol·L），以及NADPH 發(fā)生體系（由10 mmol·L葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽，0.5 mmol·LNADPNa和1 U·mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成）。在加入NADPNa前，將孵育體系在37℃下預(yù)孵育5 min，加入NADPNa啟動(dòng)反應(yīng)并計(jì)時(shí)。在一定時(shí)間（5 ～120 min）后，孵育體系按“2.3”項(xiàng)下方法操作，終止孵育反應(yīng)，處理樣品并進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 空白孵育體系樣本的制備 制備含0.2 mg·mL的肝微粒體蛋白、0.1 mol·L的PBS緩沖液、10 mol·L的MgCl以及NADPH 發(fā)生體系（由10 mol·L葡萄糖-6-磷酸二鈉鹽，0.5 mol·LNADPNa和1 U·mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶組成）的混合液，置 37℃水浴30 min 后，混勻，作為空白孵育體系樣本。

2.5.2 專屬性考察 分別取空白孵育體系樣本，空白孵育體系樣本添加探針底物（咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、枸櫞酸莫沙必利和格列吡嗪對照品的標(biāo)準(zhǔn)溶液）適量，以及探針底物孵育體系樣品，照“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。典型色譜圖如圖1 所示，結(jié)果表明空白孵育體系樣本中共存物不干擾色譜分析。

圖1 典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram

2.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及最低檢測限（LOD） 精密吸取20 μL 混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液，置1.5 mL 高速離心管中，加入空白孵育體系樣本180 μL，混勻，制成咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲濃度分別為0.04 ～20、0.02 ～10、0.02 ～10、0.02 ～10、0.08 ～40 和0.1 ～50 μmol·L的標(biāo)準(zhǔn)孵育樣品（每個(gè)樣品200 μL），照“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。記錄待測物色譜峰面積（

A

）與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積（

A

），以峰面積比

R

（

R

＝

A

/

A

）對濃度（

C

，μmol·L）進(jìn)行線性回歸。由于標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的色譜圖的各待測物峰的信噪比

S/N

均＞10，因此以標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)的濃度作為定量限（LOQ）；繼續(xù)制成更低濃度的標(biāo)準(zhǔn)孵育品，處理后進(jìn)樣分析，以峰信噪比

S/N

≥3 時(shí)的濃度為LOD，結(jié)果見表2。6 種底物探針的標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.995，線性關(guān)系良好；6 種底物探針的LOD 均在其標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)濃度的25%及以下，方法靈敏度高。

表2 6 種底物探針的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及定量限檢測限
Tab 2 Standard curve equation，limit of quantitation and detection for 6 substrate probes

探針底物標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù) 線性范圍/（μmol·L－1） 定量限/（μmol·L－1） 檢測限/（μmol·L－1）咖啡因C ＝1.9236R－0.02770.99860.04 ～200.040.01氫溴酸右美沙芬C ＝0.7266R－0.01780.99760.02 ～100.020.005馬來酸咪達(dá)唑侖C ＝0.4645R－0.00350.99950.02 ～100.020.002奧美拉唑C ＝0.6904R－0.02260.99690.02 ～100.020.001氯唑沙宗C ＝0.8070R ＋0.00410.99580.08 ～400.080.02甲苯磺丁脲C ＝0.7684R ＋0.03040.9989 0.1 ～500.10.025

2.5.4 準(zhǔn)確度和精密度 分別精密吸取20 μL 低中高三種濃度水平的混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液，置1.5 mL 高速離心管中，加入空白孵育體系樣本180 μL，混勻，制成含咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲分別為0.1、0.05、0.05、0.05、0.2 和0.25 μmol·L，1、0.5、0.5、0.5、2 和2.5 μmol·L，16、8、8、8、32 和40 μmol·L的三種濃度水平標(biāo)準(zhǔn)孵育樣品（每個(gè)樣品200 μL）。照“2.3”項(xiàng)下方法操作，進(jìn)樣分析。在一個(gè)分析批內(nèi)測定5次，計(jì)算批內(nèi)精密度；在不同天制備并測定3 個(gè)分析批，計(jì)算批間精密度。結(jié)果顯示，6 種底物探針的準(zhǔn)確度在93.66%～107.59%，批內(nèi)批間

RSD

均≤7.9%，方法的準(zhǔn)確度、精密度良好，符合生物樣本的測定要求。2.5.5 提取回收率 同“2.5.4”項(xiàng)下方法制備，每個(gè)濃度水平各5 份，即得回收率供試液。另分別取200 μL 空白孵育體系樣本經(jīng)甲醇沉淀處理后，取上清液，再加入與回收率供試液等量的混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)渦旋混勻和高速離心后，獲得上清液，每個(gè)濃度水平各2 份。計(jì)算提取回收率供試組與提取回收率對照組的峰面積比值，即得樣品處理方法的提取回收率。結(jié)果6 種底物探針的高、中、低濃度的平均提取回收率均＞90%，且穩(wěn)定（5 份樣品提取回收率的

RSD

值均≤7.0%）。2.5.6 基質(zhì)效應(yīng) 基質(zhì)供試組：與“回收率對照組”同法制備，每個(gè)濃度水平各5 份。基質(zhì)對照組：取甲醇-水（3∶1）精密加入與基質(zhì)供試組等量的混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成三個(gè)濃度水平的溶液?；|(zhì)效應(yīng)為基質(zhì)供試組峰面積與基質(zhì)對照組峰面積的比值，用以考察不可見干擾（即共流出成分，主要指內(nèi)源性成分）對待測物和內(nèi)標(biāo)物離子化效率的影響，內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)均在87.03%～110.08%，6 種底物探針的基質(zhì)效應(yīng)均在93.02%～105.23%，

RSD

值均≤10.4%，表明生物基質(zhì)對樣品和內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜響應(yīng)均無影響。

2.5.7 穩(wěn)定性

① 標(biāo)準(zhǔn)溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)：取咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲單標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋成濃度分別為0.4、0.2、0.2、0.2、0.8、1 μmol·L的混合探針標(biāo)準(zhǔn)工作液；取1.0 mg·mL枸櫞酸莫沙必利和格列吡嗪單標(biāo)儲(chǔ)備液稀釋成質(zhì)量濃度分別為200 ng·mL和300 ng·mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。將上述標(biāo)準(zhǔn)工作液在室溫放置0、4、8 h 后進(jìn)樣分析，用以考察標(biāo)準(zhǔn)工作液的穩(wěn)定性。將以上單標(biāo)儲(chǔ)備液置于4 ℃冰箱中冷藏7 d 后，再稀釋成上述濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液后分析，用以考察標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的穩(wěn)定性。

② 自動(dòng)進(jìn)樣器放置穩(wěn)定性：將“2.5.4”項(xiàng)下三種濃度水平的樣品溶液于自動(dòng)進(jìn)樣器（15 ℃）中放置0、4、8、12 和24 h 后進(jìn)樣分析，用以考察樣品溶液的穩(wěn)定性。

穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表明混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合內(nèi)標(biāo)工作液在室溫放置8 h 以及各單標(biāo)儲(chǔ)備液冷藏放置7 d 均穩(wěn)定；樣品溶液在自動(dòng)進(jìn)樣器中放置24 h 穩(wěn)定。

2.6 模型藥物吲達(dá)帕胺對大鼠CYP450 酶的影響研究

2.6.1 孵育條件的選擇 考察不同微粒體蛋白質(zhì)量濃度（0.2、0.5、1.0 和2.0 mg·mL）和不同反應(yīng)時(shí)間（5、10、20、30、60 和120 min），照“2.4”項(xiàng)下方法操作。根據(jù)已確立的分析方法測定探針底物的濃度（

C

）和初始濃度（

C

），根據(jù)探針底物的消耗計(jì)算其代謝轉(zhuǎn)化率（

R

）：

R

＝（

C

－

C

）/

C

。合適的孵育條件為探針底物具有適中的代謝轉(zhuǎn)化率，最終確定孵育條件如表3。

表3 各探針?biāo)幬镒罱K確定的孵育條件
Tab 3 Final incubation condition for each probe drug

探針?biāo)幬锓跤龡l件微粒體蛋白質(zhì)量濃度/（mg·mL－1）反應(yīng)時(shí)間/min馬來酸咪達(dá)唑侖0.210氫溴酸右美沙芬、奧美拉唑、氯唑沙宗0.530咖啡因、甲苯磺丁脲1.060

2.6.2 正式孵育實(shí)驗(yàn) 按“2.6.1”項(xiàng)下確定的3個(gè)孵育條件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組。對照組含“2.4”項(xiàng)下的孵育體系，不含吲達(dá)帕胺；實(shí)驗(yàn)組在對照組孵育體系基礎(chǔ)上，還包含吲達(dá)帕胺，濃度分別為0.2、0.5、2、5、20、50 和200μmol·L。每組平行3 份，按已確立的分析方法測定每份孵育樣品中咖啡因、氫溴酸右美沙芬、馬來酸咪達(dá)唑侖、奧美拉唑、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的濃度。

2.6.3 孵育實(shí)驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)測得的不同樣品的探針?biāo)幬锸Ｓ酀舛龋?p>C

）和已知的初始濃度（

C

），計(jì)算代謝轉(zhuǎn)化率

R

。以對照組的探針代謝轉(zhuǎn)化率（

R

）為100%，計(jì)算不同實(shí)驗(yàn)組的相對代謝轉(zhuǎn)化率（

R

）：

R

＝

R

/

R

×100%。吲達(dá)帕胺對6 種探針底物代謝的影響如圖2 所示。所得結(jié)果經(jīng)單因素方差分析及多重組間比較（SPSS 11.5），

P

＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，結(jié)果見圖2。與對照組相比，在吲達(dá)帕胺濃度為0.02 ～200 μmol·L，實(shí)驗(yàn)組中咪達(dá)唑侖、右美沙芬、咖啡因的相對代謝率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；當(dāng)吲達(dá)帕胺增加至200 μmol·L時(shí)，甲苯磺丁脲的相對代謝率和氯唑沙宗的相對代謝率明顯降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01）；當(dāng)吲達(dá)帕胺增加至50、200 μmol·L時(shí)，奧美拉唑的相對代謝率明顯降低（

P

＜0.01）。因此，吲達(dá)帕胺對CYP3A4、CYP2D6 和CYP1A2 無抑制作用，對CYP2C9 和CYP2E1 有潛在抑制作用（半數(shù)抑制濃度

IC

均＞50 μmol·L，可認(rèn)為基本無抑制作用），對CYP2C19 有抑制作用。

圖2 吲達(dá)帕胺對探針底物在肝微粒體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化率影響Fig 2 Effect of indapamide on the metabolic conversion rate of probe substrates in liver microparticles

3 討論

本研究建立了LC-MS/MS 法同時(shí)評(píng)價(jià)肝微粒體中6 種CYP450 酶活性的方法，經(jīng)過系統(tǒng)的方法學(xué)驗(yàn)證，具備簡單、準(zhǔn)確、快速、可靠等優(yōu)點(diǎn)。通過流動(dòng)注射方式對各待測物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，6 種探針底物在正負(fù)離子模式分時(shí)間段檢測，優(yōu)化的質(zhì)譜條件響應(yīng)良好。待測物和內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間合適，靈敏度高，峰形尖銳，可在一次進(jìn)樣分析過程中完成正負(fù)模式切換，單針分析時(shí)間僅為11 min，提高了高通量樣本分析效率，且樣品前處理簡便。與已報(bào)道的LC-UV 方法比較，更加省時(shí)高效，適合用于快速評(píng)估藥物對CYP450 酶活性的影響。

臨床常見的藥物相互作用主要出現(xiàn)在體內(nèi)代謝過程中，主要是由CYP450 酶介導(dǎo)的，研究藥物對CYP450 酶的影響可以預(yù)測潛在的藥物相互作用。吲達(dá)帕胺為常用的降壓用利尿劑，臨床聯(lián)合用藥普遍，并且其體內(nèi)代謝途徑復(fù)雜，是多種CYP450 同工酶的底物，其發(fā)生藥物相互作用的風(fēng)險(xiǎn)較大。目前未見有吲達(dá)帕胺對CYP450 酶活性影響的研究，但其在聯(lián)合用藥中不良反應(yīng)時(shí)有發(fā)生。本研究首次測定了吲達(dá)帕胺對CYP450 酶的影響，發(fā)現(xiàn)吲達(dá)帕胺對CYP2C19 活性有抑制作用。因此，當(dāng)合用藥物經(jīng)CYP2C19 代謝時(shí)，可能導(dǎo)致藥物的血藥濃度升高而產(chǎn)生不良反應(yīng)。但是本研究僅對同吲達(dá)帕胺合用時(shí)具有潛在不良反應(yīng)的藥物進(jìn)行初篩，具體的藥物尚需體內(nèi)研究和臨床試驗(yàn)加以確證。