金茵利膽膠囊的高效液相色譜指紋圖譜及其抗氧化作用的灰色關聯分析

曹凡，陳琳，宋忠興，唐志書，3*，倪健（.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 7000；.陜西省中藥資源產業化協同創新中心，秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育），陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 7083；3.中國中醫科學院，北京 00700；4.北京中醫藥大學北京中醫藥研究院，北京 0009）

中藥復方制劑金茵利膽膠囊由茵陳、金錢草、郁金和枳殼四味藥材加工制成，具有疏肝利膽、清熱除濕之功效，臨床上廣泛應用于肝膽濕熱證的改善，療效顯著。茵陳、金錢草作為“保肝要藥”“排石金藥”，常作為保肝利膽的藥材在復方中發揮作用。現代藥理學研究表明，茵陳中主要是綠原酸、對羥基苯乙酮、6，7-二甲氧基香豆素、茵陳色原酮等化學成分發揮利膽作用，且綠原酸有很好的保肝作用。金錢草全草含有槲皮素等黃酮類化合物以及多糖等成分，具有清熱解毒、抗炎、利濕退黃等藥理活性。

金茵利膽膠囊現行企業標準“含量測定”項下，規定采用枳殼中柚皮苷作為檢測指標進行含量測定，本品每粒含枳殼以柚皮苷（CHO）計，不得少于0.8 mg，以達到對金茵利膽膠囊進行質量控制的目的。單一成分的含量測定不能對制劑的質量進行全面有效控制。市面上金茵利膽相關復方制劑還包括金茵利膽口服液、金茵利膽靈合劑以及金茵利膽顆粒。筆者通過查閱文獻，發現僅有金茵利膽口服液指紋圖譜、柚皮苷和橙皮苷含量測定以及金茵利膽顆粒中綠原酸含量測定的相關報道，未見金茵利膽膠囊化學成分的定性定量分析。本研究采用HPLC 對15 批金茵利膽膠囊樣品進行相似度分析，建立其譜效關系，以期為金茵利膽膠囊的指標性成分篩選以及質量控制提供有效的分析方法和數據支持。

1 材料

1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 安捷倫）；Milli-Q 純水/超純水一體機（美國Millipore公司）；ME204 電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；CPA225D 電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；KQ-300DE數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；VORTEX-5 漩渦混勻儀（海門其林貝爾儀器有限公司）。

新綠原酸（批號：HR20422B1）、隱綠原酸（批號：HR20423B1）、綠原酸（批號：HCD21133198）、1，3-二咖啡酰奎寧酸（批號：H0071330198）（對照品，寶雞辰光生物科技有限公司）；對羥基苯乙酮（批號：111897-201602）、柚皮苷（批號：110722-201815）、新橙皮苷（批號：1108091857-201804）（對照品，中國食品藥品檢定研究院）；各對照品純度均大于98%。金茵利膽膠囊（S1 ～S15，批號：20200301，20200302，20200401，20200402，20200403，20200404，20200501，20200601，202000901，20200902，20201001，20201002，20201003，20201004，20201101，陜西盤龍藥業集團股份有限公司）。甲醇（分析純，成都市科隆化學品有限公司）；甲醇、乙腈（色譜純，Honeywell公司）；磷酸（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱InertSustain C（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相0.05% 磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0 ～8 min，5%～12%B；8 ～14 min，12% ～15%B；14 ～26 min，15% ～27%B；26 ～30 min，27% ～28%B；30 ～41 min，28% ～40%B；41 ～54 min，40% ～80%B；54 ～55 min，80%～5%B；55 ～65 min，5%B；后運行5 min）； 流速1.0 mL·min； 柱溫30 ℃；檢測波長282 nm；進樣量5 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取新綠原酸、隱綠原酸、綠原酸、1，3-二咖啡酰奎寧酸、對羥基苯乙酮、柚皮苷和新橙皮苷對照品適量，加甲醇配成單一對照品儲備溶液。吸取各對照品儲備液適量，稀釋成質量濃度分別為0.3、0.3、0.167、0.1、0.133、0.6、0.3 mg·mL的混合對照品儲備溶液，4℃保存，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備 取金茵利膽膠囊內容物約0.3 g，精密加入70% 甲醇9 mL，密塞，稱重，超聲處理30 min（功率300 W，頻率40 kHz，超聲溫度45 ℃），放冷，70% 甲醇補足，搖勻，3000 r·min離心2 min，0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 按處方比例取金錢草、茵陳、郁金和枳殼單味藥材以及缺金錢草、缺茵陳、缺郁金和缺枳殼的樣品，按金茵利膽膠囊生產工藝制備，過濾，濃縮，噴霧干燥，得到各單味藥材以及陰性樣品干燥粉末，按“2.2.2”項下方法制備即得。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號：20190902）制備成供試品溶液，連續進樣6次，記錄色譜圖中各峰面積。以21 號峰（柚皮苷）為參照峰，23 個共有峰相對保留時間

RSD

值均小于1.0%，相對峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。2.3.2 重復性 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號：20190902）制備成供試品溶液6 份，進樣測定。以21 號峰（柚皮苷）為參照峰，23 個共有峰相對保留時間

RSD

值均小于1.0%，相對峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明本方法的重復性良好。2.3.3 穩定性 取同一批金茵利膽膠囊樣品（批號：20190902）制備成供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 各進樣1 次，記錄色譜峰面積。以21 號峰（柚皮苷）為參照峰，23 個共有峰相對保留時間

RSD

值均小于1.0%，相對峰面積的

RSD

值均小于3.0%，表明供試品溶液在24 h 內穩定。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 多批樣品指紋圖及共有峰 精密稱取15批金茵利膽膠囊內容物約0.3 g，制成供試品溶液。取供試品溶液各5 μL，進樣測定，記錄色譜圖。采用國家藥典委員會的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012 版）”，分析15 批樣品HPLC 色譜圖，時間窗寬度設為0.3 min，采用中位數法；通過多點校正后，全峰匹配圖譜；得到15 批金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜共有模式見圖1，得到23 個共有峰。

圖1 15 批金茵利膽膠囊的HPLC 指紋圖譜Fig 1 HPLC fingerprint of 15 batches of Jinyin Lidan capsules

2.4.2 相似度評價 以S1 為對照圖譜，對金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜進行相似度計算。結果顯示，15 批金茵利膽膠囊樣品的指紋圖譜與對照圖譜的相似度均大于0.900。

2.4.3 特征峰的指認及歸屬 根據色譜峰保留時間穩定、峰面積相對較高及檢測率達100%的原則，經過與混合對照品PDA 光譜圖對比，共指認了其中7 個共有峰，分別為新綠原酸（9 號峰）、隱綠原酸（13 號峰）、綠原酸（14 號峰）、1，3-二咖啡酰奎寧酸（16 號峰）、對羥基苯乙酮（17 號峰）、柚皮苷（21 號峰）、新橙皮苷（23 號峰）。混合對照品和代表性樣品（S1）的HPLC 圖見圖2。

圖2 混合對照品（A）、金茵利膽膠囊 S1（B）的HPLC 圖Fig 2 HPLC chromatogram of mixed control（A）and Jinyin Lidan capsule S1（B）

分別吸取供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，記錄色譜圖。依據各色譜峰的紫外吸收光譜和相對保留時間，確定各特征峰的歸屬。其中，9 號峰新綠原酸、13 號峰隱綠原酸、14 號峰綠原酸、16 號峰1，3-二咖啡酰奎寧酸17 號峰對羥基苯乙酮歸屬于茵陳，21 號峰柚皮苷歸屬于枳殼，23 號新橙皮苷歸屬于茵陳、枳殼。各藥材、陰性樣品以及樣品的HPLC 圖見圖3。

圖3 金茵利膽膠囊、單味藥材以及各陰性藥材HPLC 圖Fig 3 Chromatogram of Jinyin Lidan capsule，single medicinal materials and negative medicine materials

2.5 抗氧化活性分析

2.5.1 供試品溶液的制備 對金茵利膽膠囊中的4 味藥材粉末進行U（7）均勻設計，茵陳按0 ～2400 mg，金錢草、郁金均按0 ～1200 mg，枳殼按0 ～600 mg 配比，得到7 組樣品配比，另外按處方原配比增設一組樣品N0，共計8 個樣品配比組（見表1）。根據均勻設計表的配比，加入樣品總重量10 倍量的70%甲醇溶解提取藥材粉末，超聲50 min，離心，取上清液，過0.45 μm 濾膜，水浴揮干甲醇。用原樣本體積15%DMSO 復溶，渦旋超聲溶解，作為供試品儲備溶液，4 ℃保存備用。

表1 金茵利膽膠囊U (7)均勻設計表
Tab 1 U (7) uniform design of Jinyin Lidan capsules

序號茵陳/mg金錢草/mg郁金/mg枳殼/mg N01200600600300 N10200400500 N24006001000400 N38001000200300 N412000800200 N516004000100 N620008006000 N7240012001200600

2.5.2 DPPH 自由基清除率 精密稱取7.88 mg DPPH 粉末，加無水乙醇定容至100 mL，得0.2 mmol·LDPPH 自由基儲備液，現配現用。取“2.5.1”項下一定量的供試品儲備溶液，加70% 甲醇配成系列質量濃度的供試品溶液（1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.031 25 mg·mL）。各吸取供試品溶液100 μL、DPPH 自由基溶液100 μL 于96 孔板中，室溫下避光反應30 min，采用酶標儀于517 nm 處測定DPPH 自由基溶液＋系列質量濃度的供試品溶液吸光度（

A

），系列質量濃度的供試品溶液（100 μL）＋70% 甲醇（100 μL）吸光度（

A

），DPPH 自由基溶液（100 μL）＋70%甲醇（100 μL）同法測吸光度（

A

）。維生素C 作為陽性對照，清除率＝[

A

－（

A

－

A

）]/

A

，采用SPSS Statistics 25 中Probit 模型預測半數抑制濃度（

IC

），結果見表2。2.5.3 ABTS 自由基清除率 分別配制7 mmol·LABTS 水溶液和2.45 mmol·LKSO水溶液，同體積混合，暗處放置12 ～16 h，使用前加蒸餾水稀釋，使其在734 nm 處吸光度為（0.8±0.02），即得ABTS 工作液。取“2.5.1”項下一定量的供試品儲備溶液，加70%甲醇配成系列質量濃度的供試品溶液（1.0、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125 mg·mL）。分別吸取各供試品溶液20 μL、ABTS 自由基工作液180 μL 于96 孔板中，室溫下避光反應10 min，采用酶標儀于734 nm 處測定ABTS 自由基溶液＋系列質量濃度的供試品溶液吸光度（

A

），系列質量濃度的供試品溶液（180 μL）＋70% 甲醇（20 μL）的吸光度（

A

），DPPH 自由基溶液（180 μL）＋70% 甲醇（20 μL）的吸光度（

A

）。維生素C 作為陽性對照，采用SPSS Statistics 25 中Probit 模型預測半數抑制濃度（

IC

），結果見表2。

表2 樣品N0 ～N7 結果
Tab 2 of sample N0 ～N7

編號IC50/（mg·mL－1）DPPHABTS維生素C0.0370.016 N00.1780.085 N10.8930.160 N20.2470.157 N30.1700.130 N40.2550.135 N50.2340.151 N60.2000.146 N70.2010.118

由表2 可以看出，不同配比的N0 ～N7 樣品均具有一定的抗氧化活性，且都弱于維生素C。綜合來看，N0抗氧化活性較強，N1抗氧化活性最弱。

3 指紋圖譜與抗氧化活性的灰色關聯分析

將清除DPPH 自由基和清除ABTS 自由基的

IC

作為母序列，23 個共有峰峰面積作為子序列，參照文獻方法，進行灰色關聯分析。對數據進行無量綱化處理，標準化處理后，計算母序列與子序列絕對差得到絕對差序列，進而求得關聯系數得到關聯度，分辨系數

ρ

取0.5。

各子序列對母序列的關聯系數平均值即得各色譜峰與DPPH 和 ABTS 活性的關聯度值，見表3 和4。將各子序列對母序列的關聯度按大小順序排列起來，組成關聯序。依據關聯度大小，確定了N0 ～N7 樣品中各成分對清除DPPH 和ABTS 自由基活性貢獻的大小順序。

表3 金茵利膽膠囊的指紋圖譜與DPPH 自由基清除活性的關聯序
Tab 3 Correlation between the fingerprint of Jinyin Lidan capsule and DPPH free radical scavenging activity

關聯序峰號關聯度關聯序峰號關聯度1120.780 13 30.735 2 90.757 14 40.735 3140.757 15190.726 4100.757 16210.726 5230.755 17110.724 6 80.755 18220.720 7170.754 19 20.719 8130.754 20180.709 9 70.754 21150.664 10200.750 22 10.636 11 50.744 23160.503 12 60.739

表4 金茵利膽膠囊的指紋圖譜與ABTS 自由基清除活性的關聯序
Tab 4 Correlation between the fingerprint of Jinyin Lidan capsule and ABTS free radical scavenging activity

關聯序峰號關聯度關聯序峰號關聯度1120.702 13190.646 2140.675 14210.646 3230.675 15 30.643 4100.674 16 40.642 5170.671 17220.638 6 80.671 18110.633 7130.671 19 20.623 8 90.669 20180.621 9 70.667 21150.565 10200.663 22 10.508 11 50.655 23160.403 12 60.649

對不同配比的N0 ～N7 樣品的HPLC 指紋圖譜中23 個共有峰峰面積與其抗氧化活性進行灰色關聯度以及關聯序分析，根據關聯度的大小確定各色譜峰對抗氧化活性的貢獻度。綜合兩者結果可以看出，峰12 抗氧化活性貢獻度最強，峰14 抗氧化活性貢獻度次之，峰16（1，3-二咖啡酰奎寧酸）抗氧化活性貢獻度最弱，其中指紋圖譜指認出峰14 為綠原酸、峰9 為新綠原酸、峰17 為對羥基苯乙酮、峰13 為隱綠原酸、峰23 為新橙皮苷關聯度排名靠前，具有一定的抗氧化貢獻力，反映出這幾個峰是其抗氧化藥效較為重要的色譜峰，在復方中發揮抗氧化的作用較大。

4 討論

本研究對15 批次金茵利膽膠囊進行指紋圖譜分析。考察了乙腈-水、甲醇-水以及乙腈-不同比例（0.05%，0.1%）的甲酸、磷酸等含酸溶液作為流動相，不同檢測波長（256、282、310、320 nm），不同柱溫（25、30 及45℃）以及不同流速（0.8、1.0 mL·min）對金茵利膽膠囊中化學成分的分離能力，結果乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動相，柱溫為30 ℃、流速為1.0 mL·min，檢測波長為282 nm 下進行梯度洗脫時，主要色譜峰分離度＞1.5，出峰數量較多，譜圖清晰，具有很好的分離效果。接著考察不同提取溶劑（50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇以及水）、藥材 ∶ 溶劑比例（1∶20、1∶30、1∶40、1∶80）、超聲時間（30、60、90 min）以及超聲溫度（25、45、60℃）對金茵利膽膠囊內容物化學成分提取的影響，最終選擇70% 甲醇，藥材∶溶劑比為1∶30，30 min 作為超聲時間，45℃作為超聲溫度為最優條件對金茵利膽膠囊化學成分進行提取。

本研究還以清除DPPH 自由基和ABTS 自由基的

IC

來評價均勻設計的8 個金茵利膽膠囊樣品的抗氧化活性。結果表明均勻設計的8 個金茵利膽膠囊樣品均具有一定的抗氧化活性，綜合分析，N0 抗氧化活性最強，N1 抗氧化活性最弱，N0 抗氧化活性最強可能的原因為原方中四味中藥的配比比較合適，所提取出的復方中的成分使其抗氧化活性最強。本研究還采用灰色關聯度分析方法，將N0 ～N7 樣品HPLC 譜圖與其抗氧化作用的關聯度進行量化分析。結果顯示，不同配比的N0 ～N7 樣品23 個共有峰與DPPH 清除率的關聯度在0.780 ～0.503，與ABTS 清除率的關聯度在0.702 ～0.403。其中，峰9 為新綠原酸、峰14 為綠原酸、峰17 為對羥基苯乙酮、峰13 為隱綠原酸、峰23 為新橙皮苷，這幾個峰是其抗氧化藥效較為重要的色譜峰，峰12 抗氧化活性最大，具體是哪種成分有待進一步鑒定。

綜上所述，本研究采用HPLC 的方法建立了金茵利膽膠囊的指紋圖譜，共標定了23 種共有峰，結合灰色關聯度分析的統計方法，將金茵利膽的“譜”與“效”進行關聯分析，為金茵利膽抗氧化活性成分的篩選及其質量控制與評價提供參考。