正源方對過氧化氫誘導的血管內皮細胞氧化應激損傷的保護作用研究

周瑞，唐志書，蘇潔，任美，任素娟，劉妍如，潘亞磊，宋忠興（陜西中醫藥大學/陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心/秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室（培育）/陜西省創新藥物研究中心，陜西 咸陽 712083）

放療是臨床上治療腫瘤的重要手段，而機體經過多次輻照，射線在殺死腫瘤細胞的同時，對正常組織也會造成不可逆的損傷。文獻報道輻照會導致水電解為氧化自由基，從而對機體細胞產生不可逆轉的氧化應激損傷。血管內皮細胞是輻照誘發機體損傷的重要防御細胞，也是最易受到氧化損傷的細胞，因而，是用于體外研究藥物抗氧化損傷的理想模型。

正源方是由西洋參、仙鶴草、南沙參、當歸、重樓組方而成的臨床經驗方，是根據李東垣《內外病辨惑論》中的“當歸補血湯”加減而來的，即原方去黃芪后，加西洋參、南沙參、仙鶴草、重樓而成，在臨床已經應用近20年，其主要功效為益氣養陰、清熱解毒，對于惡性腫瘤放療及特殊輻射損傷引起的血小板減少，白細胞下降，毛發脫落，皮膚紅疹、斑疹、紫癜等癥具有較好的療效，能有效改善放療后氣血虧虛患者中醫證候表現，并且緩解患者因放療引起的毒副作用。前期本課題組完成了正源方的提取工藝研究及特征指紋圖譜建立，也有研究證實了正源方對輻射動物和化療引起的動物損傷具有較好的治療效果。但是，正源方的體外抗氧化損傷作用尚不明確。因此，本文通過過氧化氫（HO）誘導人臍靜脈血管內皮細胞（HUVEC）構建氧化損傷模型，探討正源方對血管內皮細胞氧化損傷的保護作用及其機制，為其抗輻射作用及臨床應用提供理論依據。

1 材料

1.1 細胞

HUVEC（北京吉納生物科技有限公司）。

1.2 試藥

正源方的提取及制備方法參考文獻，Ham’s F-12K 培養基（武漢普諾賽生命科技有限公司）；胎牛血清、青鏈霉素混合液（Biological Industries）；30%HO、MTT、二甲基亞砜（DMSO）（天津市科密歐化學試劑有限公司）；ECL 超敏發光液（上海天能科技有限公司）；羅丹明123 檢測試劑盒、活性氧檢測試劑盒（碧云天生物）；乳酸脫氫酶（LDH）檢測試劑盒（批號：A020-2-2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）檢測試劑盒（批號：A001-1-1）及丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：A003-4-1）（南京建成生物工程材料有限公司）；RIPA 細胞裂解液（批號：HJ194302）、BCA 蛋白定量試劑盒（批號：U9229）（天根生物科技有限公司）；p-38 蛋白抗體、p-p38 蛋白抗體（萬類生物）；p-JNK 蛋白抗體、JNK 蛋白抗體、p-ERK 蛋白抗體（Cell signaling Techenology 公司）；ERK 蛋白抗體、兔二抗（美國Proteintech 公司）。

1.3 儀器

細胞培養箱、全波長酶標儀（美國賽默飛世爾科技公司）；相差顯微鏡（重慶中顯光電儀器有限公司）；IX73 倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯）；超潔凈工作臺（蘇凈安泰儀器有限公司）；流式細胞儀（美國BD 公司）；凝膠電泳儀和凝膠成像儀、電泳條帶灰度值分析軟件Image Lab（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

HUVEC 的培養基組成為89% Ham’s F-12K培養基，10%胎牛血清和1%雙抗，培養箱條件為37℃、5%CO。

2.2 正源方提取液的制備

正源方提取液的制備參考文獻方法。稱取干燥的正源方粉末10 mg，用1 mL PBS 超聲條件下溶解，配制成 10 mg·mL的母液，于4 ℃冰箱保存備用。

2.3 正源方對細胞存活率的影響

將生長良好的HUVEC 按5×10個細胞/孔的密度接種于96 孔板中，過夜。分為5 組：對照組、模型組（500 μmol·LHO）、正源方低劑量組（50 μg·mL）、正源方中劑量組（100 μg·mL）和正源方高劑量組（200 μg·mL）。不同質量濃度正源方預培養3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養24 h，棄去培養基，PBS洗滌2 次， 每孔加入100 μL MTT 溶液（0.5 mg·mL），4 h 后每孔加入 150 μL DMSO，在490 nm 處采用酶標儀檢測各樣本吸光度（

A

），計算細胞存活率。

2.4 正源方對H2O2 誘導的細胞線粒體膜電位的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個細胞/孔的濃度接種于6 孔板中。同“2.3”項下分為5 組。正源方預處理細胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養24 h，棄去培養基，PBS 洗滌2 次，加入4%多聚甲醛固定細胞15 min，PBS 清洗2遍，避光條件下，在37℃中加入2 μmol·L羅丹明123 染色30 min。采用倒置熒光顯微鏡觀察染色的細胞。使用Image J 1.43 統計各組中相同面積的十個區域的細胞平均熒光強度以及相同面積的十個區域內的平均細胞數目。

2.5 正源方對H2O2 誘導的細胞產生活性氧（ROS）的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個細胞/孔的濃度接種于6 孔板中。分為4 組：空白組（不含熒光探針）、對照組、HO處理組（500 μmol·L）和正源方處理組（200 μg·mL）。正源方預處理細胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養24 h，用無血清培養基清洗細胞，用10 mmol·LDCFH-DA 在37℃染色20 min，離心收集細胞。用無血清培養基洗滌細胞，并使用流式細胞儀（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）檢測各組樣品的熒光強度。

2.6 正源方對H2O2 誘導的細胞產生LDH、MDA及SOD 的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個細胞/孔的濃度接種于6 孔板中。按“2.3”項下方法分為5 組。正源方預處理細胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養24 h，收集各組細胞上清液，使用LDH 和T-SOD 檢測試劑盒，按照試劑盒說明書檢測LDH 和超氧化物歧化酶（SOD）水平。此外，收集各組細胞勻漿樣品，細胞勻漿采用MDA 檢測試劑盒操作流程對MDA 水平進行檢測。最后，通過酶標儀分別在450、530 及550 nm 下測定LDH、MDA 和SOD 的吸光度（

A

）。并采用GraphPad Prism Version 5（GraphPad Software，Inc.，CA，美國）進行數據統計分析。

2.7 正源方對H2O2 誘導的細胞中MAPK 通路關鍵蛋白表達的影響

將生長良好的HUVEC 按1×10個細胞/孔的濃度接種于6 孔板中。按照“2.3”項下方法分為4 組：對照組、模型組、正源方中劑量組、正源方高劑量組。正源方預處理細胞3 h 后，加入500 μmol·LHO，培養24 h，收集細胞，按照RIPA 裂解液說明書提取蛋白，采用BCA 蛋白定量試劑盒測定蛋白質濃度，加入上樣緩沖液，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對等量的蛋白質進行電泳分離，并將其轉移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜在室溫下用5%脫脂奶封閉1 h，然后加入p-ERK、ERK、p-JNK、JNK、p-p38 及p38 抗體，4℃孵育過夜，將膜用TBST 洗滌后，加入山羊抗兔二抗，在室溫下孵育40 min。洗滌膜，加入ECL 發光液，采用凝膠成像系統曝光。

2.8 統計學方法

所有數據以至少3 次獨立實驗的

x

±

s

表示。均數的比較采用單因素方差分析（ANOVA）。使用GraphPad Prism Version 5 對結果進行統計分析。

P

＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 正源方對H2O2 誘導的細胞活力的影響

如圖1 所示，與對照組相比，500 μmol·LHO處理可顯著降低細胞活力，而經過不同濃度正源方預處理，可以抑制HO誘導的細胞活力減少，其中50 ～200 μg·mL呈現濃度依賴性的提高細胞活力（

P

＜0.001）。結果表明正源方處理能夠改善HO誘導的細胞活力減少。

圖1 正源方對H2O2 誘導的細胞活力減少的影響Fig 1 Effect of ZYP on the decreased cell viability in H2O2-induced HUVECs

3.2 正源方對H2O2 誘導的細胞線粒體膜電位的影響

采用羅丹明123 染色分析細胞線粒體膜電位的變化，以確定正源方對細胞線粒體膜電位的影響。如圖2A 所示，與對照組相比，HO處理組的細胞中綠色熒光強度較弱，暗示線粒體膜電位可能受損，而不同濃度正源方預處理可以增強細胞中的綠色熒光強度。采用Image J 軟件分析各處理組中10 個相同面積區域內細胞的平均熒光強度（見圖2B）和平均細胞數量（見圖2C）。通過比較發現，正源方可以顯著保護HO誘導的細胞熒光強度減少（

P

＜0.001）和細胞數目減少（

P

＜0.001），提示其可能改善了HO誘導的線粒體功能損傷。

圖2 正源方對H2O2 誘導的細胞線粒體膜電位的影響Fig 2 Effect of ZYP on the change of mitochondria membrane potential in H2O2-induced HUVECs

3.3 正源方對H2O2 誘導的細胞中ROS 水平的影響

本文通過流式細胞儀檢測正源方對HO誘導的細胞中ROS 水平的影響。結果如圖3A 所示，與對照組相比，500 μmol·LHO處理細胞顯著增強了細胞內DCFH-DA 熒光（橘色峰），提示HO誘導細胞產生過量的ROS。然而200 μg·mL正源方處理后，可以顯著減少細胞中DCFH-DA 熒光（綠色峰）。通過進一步分析每組樣品中的平均熒光強度可知（見圖3B），正源方能夠顯著抑制HO誘導的細胞內ROS 水平（

P

＜0.001）。結果表明正源方的抗氧化作用與抑制ROS 水平有關。

圖3 正源方對H2O2 誘導的細胞中ROS 水平的影響Fig 3 Effect of ZYP on the level of ROS in H2O2-induced HUVECs

3.4 正源方對H2O2 誘導的細胞中LDH、MDA及SOD 水平的影響

與對照組相比，經500 μmol·LHO處理的細胞中LDH 和MDA 的水平顯著提高，SOD水平顯著下降，正源方不同濃度處理組可以濃度依賴性地降低HO誘導的LDH 和MDA，提高SOD 水平。結果表明正源方的抗氧化損傷可能與調節氧化因子LDH、MDA 和SOD 水平相關（見圖4）。

圖4 正源方對H2O2 誘導的細胞中LDH、MDA 和SOD 水平的影響Fig 4 Effect of ZYP on the level of LDH，MDA and SOD in H2O2-induced HUVECs

3.5 正源方對H2O2 誘導的細胞中MAPK 通路關鍵蛋白表達的影響

結果如圖5 所示，與對照組相比，500 μmol·LHO處理可以顯著提高細胞中MAPK通路關鍵蛋白p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 蛋白的表達，正源方處理后，可以顯著抑制HO誘導的p-p38/p38、p-JNK/JNK、p-ERK/ERK 蛋白表達。結果表明，正源方的抗氧化損傷活性可能與調控MAPK 通路相關。

圖5 正源方對H2O2 誘導的細胞中MAPK 通路關鍵蛋白表達的影響Fig 5 Effect of ZYP on the key proteins expression of MAPK pathway in H2O2-induced HUVECs

4 討論

近年來由于臨床腫瘤患者增多，放射治療和放射損傷引起的毒副作用已不容忽視。正源方可減輕放射治療引起的毒副作用。根據放射治療可導致機體過量的氧化應激，進一步造成機體的氧化平衡失衡，我們推測正源方減輕放療引起的毒副作用，可能與其抗氧化應激損傷的作用有關。因此，本文通過構建體外氧化應激造成的血管內皮細胞損傷模型，初步評價正源方的抗氧化損傷作用及其作用機制。正源方中含有的人參皂苷Rb及人參皂苷Rg對氧化應激的抑制作用，推測正源方的抗氧化活性可能是這些化合物的聯合作用。

輻射產生高水平的ROS，破壞機體正常的氧化還原平衡，使細胞處于氧化應激狀態。ROS能使酶失活，氧化蛋白質，破壞DNA，引起脂質過氧化，使蛋白質變性，破壞細胞功能和完整性。ROS 主要在線粒體中產生并在細胞輻射過程中發生積累。因此，抑制機體氧化應激可以起到抗輻射損傷的作用。LDH 是穩定存在于細胞質中的胞漿酶，當細胞膜受到氧化損傷時LDH 釋放，細胞培養上清中LDH 表達升高，提示細胞膜破損。MDA 是自由基作用于脂質發生過氧化反應的氧化產物，是機體氧化應激的另一個關鍵指標，具有細胞毒性。MDA 的含量可反映機體脂質過氧化速率和程度，同時間接反映組織過氧化損傷程度。當機體發生氧化應激損傷時，MDA表達增多。此外，SOD 通過清除機體有害的超氧陰離子自由基（O），具抗氧化和抗衰老的作用。研究發現SOD 的產生可以降低ROS 的有害影響。 因此，ROS、LDH、MDA 及SOD 水平在抵御氧化應激研究中至關重要。本研究發現HO誘導的血管內皮細胞中ROS、LDH 及MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低，而不同濃度正源方處理能夠顯著抑制ROS、MDA 和LDH 的過量產生，提高SOD 的表達水平，表明正源方能夠保護細胞免受HO誘導的氧化損傷。

MAPK 通路是參與細胞氧化應激、凋亡、增殖和應激反應等多種細胞過程的重要信號通路。以往研究表明，HO處理可激活血管內皮細胞中的MAPK 通路。ROS 引發氧化應激可以激活MAPK 通路，可以通過磷酸化ERK、JNK 和p38 MAPKs 的表達水平來監測。研究證實MAPK 家族信號通路在調控HO誘導的細胞氧化損傷和凋亡中發揮重要作用。據報道多個中藥可通過調控HO誘導的MAPK 通路實現對細胞氧化損傷和凋亡的保護作用。因此，本文進一步檢測了正源方對HO誘導的細胞中MAPK 通路關鍵蛋白的激活情況。與預期一致，HO處理組顯著上調了p-p38/p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK 的表達水平，表明HO處理誘導MAPK 信號的過度活化，使氧化應激水平失衡，線粒體損傷，導致線粒體膜電位下降，細胞中ROS 表達水平升高，分泌LDH 和MDA 增多，SOD 產生減少，細胞活力下降。正源方預處理顯著降低了p-p38/p38、p-JNK/JNK 和p-ERK/ERK的表達水平。可知正源方處理后細胞中線粒體膜電位升高，細胞分泌ROS、LDH 及MDA 減少，SOD 增加。基于以上發現，本文推測正源方促進細胞存活，抑制HO誘導的氧化應激相關因子，可能與抑制MAPK 通路的活化有關。

本研究證實了正源方對HO誘導的內皮細胞氧化應激損傷具有保護作用，并初步探討了正源方的抗氧化損傷作用可能與抑制MAPK 通路的活化有關。本文不足之處主要有以下三方面：①HO誘導的損傷模型并不能完全模擬輻射引起的損傷，只是具有一定的可比性；② 只初步探索了正源方對HO誘導的氧化應激指標的抑制作用，并且對MAPK 通路活化的抑制作用，而未深入探究正源方調控MAPK 通路與氧化應激指標之間的關系；③ 未采用陽性對照藥。在未來研究中，應采用輻射誘導的細胞和動物損傷模型，并選擇合適的陽性對照藥，進一步評價正源方抗輻射的作用機制。以上研究表明，通過HO誘導的細胞損傷可初步用來評價正源方的抗氧化損傷作用及作用機制，本研究可為正源方的氧化損傷保護作用及臨床應用提供一定理論參考。