石榴皮安石榴苷純化工藝及穩定性研究

牛若惠，常占瑛，熱娜·吉恩斯，高曉黎，2*（.新疆醫科大學藥學院，烏魯木齊 8300；2.新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室，烏魯木齊 8300）

石榴（

Punica granatum

L.）是石榴科石榴屬植物。石榴皮為石榴的干燥果皮。研究發現，石榴皮中富含多酚類、生物堿類、黃酮類、氨基酸和有機酸等化學物質，具有澀腸止瀉、止血、驅蟲等功效。石榴皮具有安全可靠、多功能、天然等優點。石榴皮多酚有很強的抗氧化活性，可用于預防和治療多種疾病如炎癥、糖尿病和心腦血管疾病等。安石榴苷（punicalagin）為石榴皮多酚的主要成分，其含量在10%左右。因其結構中含有較多羥基，也具有很強的抗氧化活性。研究表明，安石榴苷還對癌癥、炎癥、病毒、糖尿病等有一定的治療效果，其可以抑制脂肪酸合成酶的活性，因此對肥胖也有一定的防治作用。此外，其還在多種慢性疾病如心血管疾病和肝臟疾病中發揮著積極的作用。目前，安石榴苷的純化方法有柱色譜分離，如大孔吸附樹脂、凝膠LH-20 色譜、MCI-gel CHP-20P、高速逆流色譜法、制備型高效液相色譜法等。膜分離技術是一種全新的高效分離、濃縮、提純的技術，其具有效率高、運行穩定及成本低等特性，近年來在中藥制藥領域得到了廣泛的應用。本試驗擬在課題組已獲得安石榴苷純化技術專利的基礎上，優化洗脫條件，并使用膜分離技術進行濃縮，進一步優化安石榴苷的純化工藝，建立簡便、高效的純化方法，以提高安石榴苷的轉移率及純度。并對制備得到的安石榴苷精制物進行穩定性考察，為其存儲提供理論依據。

1 材料

1.1 試藥

安石榴苷粗品（試驗室自制，經HPLC 測定含量為45%）；安石榴苷對照品（純度大于98.82%，批號：MUST-20050502）、鞣花酸對照品（純度大于 99.65%，批號：MUST-17052603）、安石榴林對照品（純度大于99.37%，批號：MUST-16030105）（成都曼斯特生物科技有限公司）；HPD500 型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；95%乙醇（食用酒精）；甲醇（色譜純，美國Sigma 公司）；三氟乙酸（Macklin）；氫氧化鈉（NaOH，天津市北聯精細化學品開發有限公司）；鹽酸（洛陽市化學試劑廠）。

1.2 儀器

LC-20AT LC-20AB 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S 型電子天平（瑞士梅特勒公司）；PB-10 型pH 計（北京賽多利斯公司）；ZXMP-AL230 恒溫恒濕箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；ZS51213340 藥品強光穩定性試驗箱（偵翔環境試驗設備）；FH-UF/NF-2 型復合型納濾濃縮裝置（江蘇凱米膜科技股份有限公司）；R-2003 型旋轉蒸發濃縮裝置（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

2 方法與結果

2.1 安石榴苷HPLC 方法學驗證及含量測定

2.1.1 色譜條件 根據課題組前期建立的質量標準，采用高效液相色譜法測定。色譜柱：Agilent SB-C色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.1%三氟乙酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0 ～15 min：97%A；15 ～25 min：80%A；25 ～35 min：55%A；35 ～40 min：35%A）；檢測波長370 nm；流速1 mL·min；進樣量10 μL；柱溫30℃。

2.1.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取安石榴苷、安石榴林、鞣花酸對照品6.5、5、5 mg 于10 mL 的棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，配制成質量濃度分別為650、500、500 μg·mL的對照品儲備液，備用（臨用時稀釋至所需質量濃度）。

2.1.3 供試品溶液的配制 精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，即得供試品溶液，備用。

2.1.4 方法學考察 分別取空白溶劑、對照品溶液及供試品溶液按照“2.1.1”項下色譜條件進行HPLC 檢測，記錄峰面積，對方法的專屬性、線性、精密度、重復性、穩定性及回收率進行考察。色譜圖見圖1，安石榴苷峰形良好，樣品的保留時間與對照品的保留時間一致，溶劑不產生干擾。安石榴苷在40.625 ～650 μg·mL與峰面積具有良好的線性關系（

A

＝5654.6

C

＋7725.5，

R

＝0.9999）。精密度、穩定性、重復性試驗的

RSD

值均小于2.0%，符合方法學要求。樣品的平均回收率為99.75%（

n

＝6），

RSD

為2.8%，表明方法準確度良好。

圖1 安石榴苷色譜圖Fig 1 Chromatogram of punicalagin

2.1.5 樣品含量測定 精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，精密量取2 mL 至10 mL 量瓶，甲醇定容至刻度混勻后，用0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液10 μL，按照“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，將峰面積代入標準曲線，計算含量。

2.2 精制工藝的優化

2.2.1 上樣液制備 根據課題組前期建立的純化工藝，采用HPD500 型大孔吸附樹脂進行分離純化，取安石榴苷粗品，用水配制成安石榴苷質量濃度為1.3 mg·mL的溶液（相當于石榴皮生藥濃度20.8 mg·mL），用HCl 調pH 至2，過濾，取濾液即得上樣液。

2.2.2 大孔吸附樹脂的預處理 取HPD500 型大孔吸附樹脂適量，95%乙醇溶液浸泡24 h 進行活化，將活化后的樹脂投入玻璃柱內，用95%乙醇溶液沖洗樹脂，洗凈至與純化水1∶5 混合不呈白色混濁，再用純化水洗至流出液不含酒精（用酒精計測量），放置，備用。

2.2.3 上樣吸附工藝條件 取pH 值為2、安石榴苷質量濃度為1.3 mg·mL的溶液5 BV，加到已預處理好的HPD500 型樹脂柱上，以2 BV·h的動態吸附速度上樣，靜態吸附12 h 后，開始洗脫。

2.2.4 計算公式

式中：

T

，安石榴苷轉移率（%）；

C

，安石榴苷的含量（%）；

Y

，安石榴苷收率（%）；

L

，安石榴苷損失率（%）；

m

，上樣液中安石榴苷的質量（mg）；

m

，洗脫液中安石榴苷的質量（mg）；

m

，上樣液流分中安石榴苷的質量（mg）；

m

，除雜洗脫液中安石榴苷的質量（mg）；

m

，安石榴苷精制物的質量（mg）；

m

，剩余安石榴苷的質量（mg）。除雜率（%）是將雜質（保留時間為11.619 min 的安石榴林及保留時間在12.76 ～13.264 min 內的未知成分）的峰面積代入安石榴苷的標準曲線，計算其質量，以洗脫液中雜質的質量/上樣液中雜質的質量進行計算。

2.2.5 單因素考察 按“2.2.1”項下方法制備上樣液，根據“2.2.3”項下方法進行上樣吸附后，以4 BV·h的流速進行洗脫，分別考察除雜溶劑（水、5%乙醇、8%乙醇、10%乙醇）、除雜溶劑洗脫終點（1、2、3、4、5、6、7、8 BV）、洗脫劑中NaOH 的濃度（0%、0.001%、0.0025%、0.005%、0.01%、0.015%）、乙醇濃度（0%、5%、10%、15%、20%、25%）、 洗脫溫度（20 ℃、30 ℃、40 ℃、45 ℃）、洗脫劑用量（1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV）對安石榴苷含量的影響。將各洗脫液進HPLC 分析，測定安石榴苷的含量。

除雜溶劑及除雜劑洗脫終點的試驗結果如表1 所示，隨著洗脫劑中乙醇濃度增大，除雜率與安石榴苷的損失率均逐漸增大，在保證安石榴苷盡可能少的損失下，8%乙醇除雜率最高，因此確定使用8%乙醇作為除雜洗脫液。8%乙醇洗脫柱體積達到6 BV 時，安石榴苷的含量開始呈線性增長趨勢（見圖2A），為了避免損失大量的安石榴苷，確定8%乙醇洗脫終點為6 BV。

表1 除雜溶劑的影響
Tab 1 Effect of impurity removal solvents

除雜溶劑除雜率/%安石榴苷損失率/%水25.01 0.28 5%乙醇36.23 0.68 8%乙醇47.08 3.56 10%乙醇53.2315.10

氫氧化鈉濃度的影響如圖2B 所示，在氫氧化鈉的濃度為0%～0.015%內，洗脫液中安石榴苷的含量隨著NaOH 濃度的增加出現先增加后降低的趨勢，在NaOH 濃度為0.01%時，洗脫液中安石榴苷的含量最高。安石榴苷呈弱酸性，在酸性條件下容易被大孔吸附樹脂吸附，堿性條件有利于洗脫，因此確定洗脫劑中加入氫氧化鈉的濃度為0.01%。

乙醇濃度的影響如圖2C 所示，安石榴苷具有很強的極性，當以水作為洗脫劑時，洗脫液中安石榴苷的含量最高。隨著乙醇濃度的增加，一些極性較小的成分會隨著安石榴苷一同洗脫，含量逐漸降低。因此確定以含0.01%氫氧化鈉的純化水作為洗脫溶劑。

洗脫溫度的影響如圖2D 所示，在洗脫溫度20 ～45℃內，洗脫液中安石榴苷的含量差異不大。考慮到安石榴苷屬于多酚類物質，對熱敏感，為了保證洗脫過程中安石榴苷的穩定性以及工藝的簡便性，因此確定于室溫條件下進行洗脫。

洗脫劑用量的影響如圖2E 所示，在洗脫過程中發現，使用含0.01%NaOH 的純化水于室溫洗脫2 BV 后，樹脂柱上黃色條帶到達最底端，此時開始接收的洗脫液中安石榴苷含量最高，自此再洗脫3 BV 后，安石榴苷的含量開始呈下降趨勢。為了得到高純度的安石榴苷精制物，確定使用含0.01%NaOH 水洗至黃色條帶到達柱底后，再收集3 BV 作為洗脫流分。

圖2 除雜溶劑洗脫終點（A）、氫氧化鈉濃度（B）、乙醇濃度（C）、洗脫溫度（D）、洗脫劑用量（E）對安石榴苷含量的影響Fig 2 Effects of impurity removal solvent elution end point（A），sodium hydroxide concentration（B），ethanol concentration（C），elution temperature（D）and eluent dosage（E）on the content of punicalagin

2.2.6 濃縮工藝比較 根據單因素試驗結果篩選的最優洗脫條件進行試驗，收集安石榴苷洗脫液流分，分成2 份，分別以減壓濃縮和膜分離（200 D 納濾膜）兩種方式進行濃縮。濃縮液經冷凍干燥得安石榴苷精制物，按照“2.1.5”項下方法測定精制物中安石榴苷含量。

減壓濃縮和納濾濃縮過程參數和結果如表2所示，安石榴苷對熱敏感，在減壓濃縮時溫度需控制在45 ℃以內，但由于該工藝中洗脫劑為水，在使用減壓濃縮除水時其濃縮效率僅20%，使用膜分離技術納濾膜濃縮可在室溫條件下進行，濃縮效率高，得到的精制物中安石榴苷的含量較減壓濃縮的高，因此選用分子量為200 D 的納濾膜對洗脫液進行濃縮。

表2 減壓濃縮和納濾濃縮對比結果
Tab 2 Vacuum concentration and nanofiltration concentration

濃縮方式濃縮過程參數樣品量/L所用時間/h濃縮后體積/L濃縮效率/%安石榴苷的含量/%溫度/℃壓力/MPa減壓濃縮45＜－0.0810282084.14納濾濃縮室溫5 ～720157586.76

2.3 驗證試驗

驗證試驗所采用的最優洗脫工藝為：上樣液靜置12 h 后，先用6 BV8%乙醇溶液除雜后，再用含0.01%NaOH 的純化水于室溫條件下洗脫至黃色條帶到達柱底后，開始接收3 BV 流分，流速為4 BV·h。使用分子量為200 D 的納濾膜對安石榴苷流分進行濃縮，濃縮液冷凍干燥得安石榴苷精制物。

3 次精制試驗所獲安石榴苷的平均轉移率為72.70%，

RSD

為2.6%（

n

＝3）；安石榴苷的平均收率為69.66%，

RSD

為1.3%（

n

＝3）；安石榴苷的平均百分含量為84.56%，

RSD

為1.6%（

n

＝3）；平均損失率為25.61%，表明精制工藝穩定可行。

2.4 安石榴苷精制物中未知組分的初步鑒定

精密稱取安石榴苷精制物25 mg 于25 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容至刻度，混勻，用0.22 μm 濾膜過濾，另取“2.1.2”項下的安石榴林及鞣花酸對照品儲備液各1 mL 于10 mL 量瓶中，定容混勻后，用0.22 μm 濾膜過濾，取續濾液進行分析，結果如圖3 所示。通過與對照品比對，確定峰2 為安石榴林，峰10 為鞣花酸。

圖3 安石榴苷精制物HPLC 圖譜Fig 3 HPLC of punicalagin refined product

2.5 安石榴苷精制物穩定性的影響因素研究

2.5.1 高溫 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中放在藥物穩定性檢查儀中（60 ℃），于0、5、10 d 取樣，觀察其外觀性狀、增減質量并測定安石榴苷的含量。并對0、5、10 d 時安石榴苷精制物中各組分進行定量分析。

安石榴苷精制物在60 ℃條件下放置5 d 后，減重4.62%，含量降低了9.0%，結果見表3。安石榴苷結構中含有多個酚羥基，高溫條件加速其被氧化而降解。精制物中除安石榴苷、安石榴林及鞣花酸外，還含6 種未知成分，通過面積歸一化法發現精制物在高溫60 ℃條件下放置10 d，安石榴苷的含量逐漸降低，安石榴林、鞣花酸、峰1 和峰4 這4 種成分含量增加，其中，安石榴林及鞣花酸為主要的降解產物。這與文獻報道一致。故安石榴苷精制物需在低溫條件下保存。

表3 高溫試驗結果
Tab 3 High temperature test

取樣時間/d外觀性狀質量變化 /% 含量測定 /%精制物中各組分面積占比/%峰1峰2（安石榴林）峰3峰4峰5峰6、7（安石榴苷）峰8峰9峰10（鞣花酸）總0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 0.771.781.530.490.2893.360.290.550.95100.0 5棕黃色疏松粉末 －4.62±0.05 77.50±1.10 1.232.551.740.940.3390.350.230.592.04100.0 10棕黃色疏松粉末 －5.14±0.15 76.10±1.67 1.373.281.711.020.3588.650.290.592.69100.0

2.5.2 高濕 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中放在恒溫恒濕箱中[相對濕度（75±5）%，25 ℃]，密閉保存，于0、5、10 d取樣，觀察其外觀性狀、增減質量并測定安石榴苷的含量。

安石榴苷精制物在相對濕度（75±5）%的條件下放置5 d 吸濕增重高達13.19%，但其含量未發生明顯變化，結果見表4。由于安石榴苷具有很強的吸濕性，應將安石榴苷精制物置于干燥環境中密封保存。

表4 高濕試驗結果Tab 4 High humidity test

取樣時間/d外觀性狀質量變化/%含量測定/%0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 5棕黃色粘連粉末13.19±0.2085.40±0.92 10棕黃色粘連粉末13.00±0.2885.87±0.99

2.5.3 強光照射 精密稱取安石榴苷精制物適量，置于敞口的稱量瓶中于澄明度檢測儀（4500±500）lx 下照射，于0、5、10 d 取樣，觀察其外觀性狀、增減質量并測定安石榴苷的含量。

安石榴苷精制物在25℃，（4500±500）lx 的強光照射下放置5 d，表層粉末出現粘連，增重2.86%，含量下降了1.7%，結果見表5，表明安石榴苷對光敏感，應注意避光貯藏。

表5 強光照射試驗結果
Tab 5 Strong light exposure test

取樣時間/d外觀性狀質量變化/%含量測定/%0棕黃色疏松粉末085.18±1.39 5棕黃色表面粘連粉末2.86±0.0583.69±0.89 10棕黃色表面粘連粉末2.92±0.0982.36±1.17

3 討論

本試驗探討了石榴皮中安石榴苷大孔吸附樹脂純化工藝，并對其穩定性進行了研究。結果表明，用6 BV 8%乙醇進行除雜后，再用含0.01% NaOH 的純化水在室溫條件下洗脫，接收3 BV 黃色條帶流分，安石榴苷總收率可達到（69.66±0.87）%，純度由（44.77±1.77）% 提高至（84.56±0.13）%。本課題組將進一步研究鑒定安石榴苷精制物中其他的組分，為安石榴苷精制物作為原料藥的應用奠定基礎。安石榴苷精制物具有很強的吸濕性，其對溫度最為敏感，在光照條件下不穩定。鞣花酸及安石榴林為安石榴苷主要的降解產物，對于安石榴苷的其他降解產物還需要進行深入研究，為了保證安石榴苷精制物的穩定性，應將其放置于低溫、干燥密閉的容器中避光存儲。

3.1 純化工藝的優點

本文根據安石榴苷的特性對其純化工藝中的解吸附條件進行了優化，首次采用含堿的水作為洗脫劑，大大節省了有機溶劑的使用量。本文首次將大孔吸附樹脂聯合膜分離技術應用于安石榴苷的純化工藝中，大孔吸附樹脂技術具有選擇性強、機械強度大、吸附容量大、吸附速度快、易再生、可循環使用、成本低等優點，在天然產物分離純化、中藥制劑的純化，有害雜質的去除等領域應用廣泛。納濾膜耗能低、成本低且可在室溫條件下進行，特別適用于對熱敏感的物質的分離。還可去除洗脫液中部分小分子量的物質如有機物、無機鹽，實現進一步純化。因此既可以得到高純度的安石榴苷又能有較高的收率。在試驗過程中從樣品溶液的吸附到解吸附及濃縮，整個工藝過程可在24 h 內完成，工藝簡單、效率較高且易于控制。并將該工藝進行了中試放大試驗，工藝可行，可以用于工業化生產。

3.2 純化工藝中的注意事項

在大孔吸附樹脂純化工藝中，洗脫劑的pH對安石榴苷的影響較大，安石榴苷為弱酸性，安石榴苷在堿性較強的條件下不穩定，應將收集的洗脫液pH 調至弱酸性，再進行濃縮。由于該工藝中所用的洗脫溶劑為水且安石榴苷對熱敏感，使用傳統的減壓濃縮不僅效率低，而且在加熱過程中容易導致安石榴苷受熱降解。因此濃縮工藝在室溫條件下進行較好。

綜上，本試驗建立的安石榴苷的純化方法有效可行，適用于安石榴苷的工業化生產，并為安石榴苷精制物的存儲提供了理論依據。