基于UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS和分子網絡技術快速鑒定五味子中聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類化學成分

阮振靚，鄧欣祺，陳倩，王亞楠，趙道通，申冰清，王宇航，鄔瑞光*，王春國*（.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 0009；.北京中醫(yī)藥大學北京中醫(yī)藥研究院，北京 0009；.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 0009）

五味子為木蘭科植物五味子

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.的干燥成熟果實，習稱“北五味子”。具有收斂固澀，益氣生津，補腎寧心之功效，用于久嗽虛喘，遺尿尿頻，久瀉不止，自汗盜汗，津傷口渴，心悸失眠等癥狀。現(xiàn)代藥理學研究表明，五味子具有保護消化系統(tǒng)、中樞神經系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)的作用，同時能夠發(fā)揮調節(jié)內分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的作用，在腎病、癌癥、咳嗽等疾病的治療方面具有廣泛的應用前景。

迄今，國內外學者已對五味子科植物進行了大量研究，共分離鑒定出約200 多個成分，其中150 多個為木脂素類，此類化合物多數(shù)具有聯(lián)苯環(huán)辛二烯型的基本骨架（如圖1 所示），其獨特的骨架和復雜的立體結構導致聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素結構多樣化，是五味子特有和主要的生物活性成分。現(xiàn)代藥理學研究表明北五味子中的聯(lián)苯環(huán)辛二烯類木脂素具有降酶保肝、抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、增強免疫等生物功能。根據化合物的結構和不同的裂解方式，聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素可以分為環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代、C7 含羥基取代的、C8 含酰氧基取代的、6，7-二羥基取代及其酯類和十一元環(huán)內酯類。

圖1 五味子聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類成分的母核結構Fig 1 Parent nucleus structure of dibenzocyclooctadiene lignans in Schisandra chinensis

液相色譜與質譜聯(lián)用（LC-MS）因其高通量和高靈敏度性能已被廣泛用于五味子木脂素類和有機酸類成分的研究，但其人工解譜耗時耗力，分子網絡技術（MN）不僅能快速對化合物進行聚類和可視化差異分析，而且能通過比較未知化合物與已知化合物結構的相似度，推測其可能的結構類型，與質譜等分析技術聯(lián)用會更快速、全面表征中藥復雜化學成分，目前該方法在中藥分析領域的應用日益被重視。

目前對五味子聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類不同亞型的質譜裂解行為和結構區(qū)分缺乏系統(tǒng)性和針對性研究，同時將液質聯(lián)用和分子網絡技術相結合快速鑒定五味子聯(lián)苯環(huán)辛二烯類化學成分的方法鮮有報道。有鑒于此，本研究基于UHPLCQ-Exactive-Orbitrap MS/MS，采用反相色譜系統(tǒng)——Cortecs C+，同時結合全球天然產物社會分子網絡（GNPS）對五味子提取物進行全面表征和主要成分聚類分析，相對理清五味子該類型化學成分物質基礎，為五味子的物質基礎研究和類似化合物的質譜裂解規(guī)律提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Q-Exactive Orbitrap 四極桿-靜電場軌道阱質譜儀：配有熱噴霧離子源（HESI）、Xcalibur 4.1 化學工作站（美國Thermo Scientific 公司）；Vanquish超高效液相色譜系統(tǒng)（DAD 檢測器，美國Thermo Scientific 公司）。Millipore Synergy UV 型超純水機（美國Millipore 公司）；Sartorious BT 25S 型萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；超聲波清洗器（北京中晟名科技有限公司，100 W）。

1.2 試藥

五味子購于北京康泰民生藥房，經北京中醫(yī)藥大學中藥學院鄔瑞光副教授鑒定為木蘭科植物五味子

Schisandra chinensis

（Turcz.）Baill.干燥成熟果實； 五味子甲素（批號：R12O08F45508，純度≥98%）、五味子乙素（批號：P24F12F139925，純度≥98%）、五味子醇甲（批號：Y30N10H104712，純度≥98%）對照品（上海源葉生物科技有限公司）；0.22 μm 微孔濾膜（天津市津騰實驗設備有限公司）；甲酸、甲醇、乙腈等（質譜純，美國Fisher 公司）。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：UHPLC CORTECS C+色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動相：0.1% 甲酸水溶液（A），乙腈溶液（B），梯度洗脫條件：0 ～3 min（5%B），3 ～45 min（5%～75%B），45 ～45.1 min（75%～5%B），45.1～50 min（5%B）；流速：0.3 mL·min；進樣量：2 μL；柱溫：35℃。

2.2 質譜條件

正離子模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350℃，噴霧電壓3.5 kV，S-Lens RF 電壓60 V，毛細管溫度300℃，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣流速35 arb，輔助氣流速流速10 arb；負離子檢出模式：HESI-Ⅱ離子源，離子源溫度350℃，電離源電壓3.2 kV，S-Lens RF電壓60 V，鞘氣和輔助氣均為高純氮氣（純度＞99.99%），鞘氣流速35 arb，輔助氣流速10 arb。

掃描模式：一級全掃描（

m/z

120 ～1800）與數(shù)據依賴性二級質譜掃描ddMS；分辨率：70 000（Full Scan），17 500（MS/MS）；碰撞模式：高能量碰撞解離（HCD），碰撞能量：NCE30，Stepped NCE50%。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲適量，加甲醇溶解配制成1 mL 溶液中含有20 μg 五味子甲素、41 μg 五味子乙素以及100 μg五味子醇甲的混合對照品溶液。

2.4 樣品溶液制備

取五味子藥材粉末（過三號篩）2 g，用70%甲醇定容于50 mL 量瓶內，超聲提取40 min。取適量過0.22 μm 微孔濾膜，置液相進樣小瓶，待測。

2.5 分子網絡構建方法

使用MsConvert 軟件將原始的LC-MS/MS 數(shù)據轉換為mzXML 格式，并上傳至GNPS 生成分子網絡，余弦分數(shù)閾值設置為0.7，最小匹配碎片離子為6，topK 設置為10，母離子和子離子質量偏差為0.02 Da，最后運用Cytoscape 軟件使分析結果可視化。分子網絡圖中可直觀顯示提取液中所有未知化合物與標準化合物之間的結構相似度，其中每一個節(jié)點表示一個化合物，結構類似的化合物分子會在一個分子網絡中聚集成簇；節(jié)點的顏色表示不同的來源；節(jié)點與節(jié)點之間的連線表示化合物之間的相關性。

2.6 質譜分析

質譜數(shù)據通過Thermo Xcalibur 4.1 軟件處理分析，對于有對照品的化合物，與對照品圖譜中各已知成分的相對保留時間、準分子離子等比對，再依據各對照品二級碎片離子信息進一步確認。對于無對照品的化合物，初步進行推測，再結合文獻報道、數(shù)據庫中相同或類似成分的MS碎片離子進行對比分析，保證對無對照品成分的準確鑒定。

3 結果與討論

本研究采用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS結合分子網絡技術共推測鑒定出31 種聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類化學成分，其中在正離子模式下檢測到的13 種聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素成分為在五味子中首次鑒定。以下是對照品具體裂解途徑分析和基于分子網絡技術對未知成分的鑒定和聚類分析。

3.1 對照品的質譜裂解行為

聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素是中藥五味子最主要的特征性成分，其中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲是五味子中非常重要的活性成分。本文首先研究上述3 個對照品的質譜裂解行為，總結其裂解規(guī)律，為其他聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類成分的推測和鑒定提供理論依據。

3.1.1 環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素質譜裂解規(guī)律 五味子甲素和五味子乙素同屬環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素類型，其區(qū)別在于C12 位的甲氧基和羥基環(huán)化的差別。對其質譜裂解行為研究發(fā)現(xiàn)，在HCD 碰撞裂解下，兩個化合物均出現(xiàn)相同或相似的碎片離子

m/z

401，402，386，316，331，330，301，300 等，說明五味子甲素在碎裂過程中首先會形成五味子乙素結構的中間碎片。該類化合物另一碎裂特征是圍繞環(huán)辛二烯環(huán)的跨環(huán)碎裂，其碎裂為C6-C7 和C8-C9 鍵斷裂、并重排氫形成穩(wěn)定的六元芳環(huán)結構，如五味子甲素主要形成

m/z

330，316，301 等碎片，其中

m/z

316 為基峰；而五味子乙素則以

m/z

300 為基峰。具體的質譜裂解行為見圖2 和圖3。

圖2 五味子甲素MS/MS 圖和質譜裂解途徑Fig 2 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin A

圖3 五味子乙素MS/MS 圖和質譜裂解途徑Fig 3 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin B

3.1.2 環(huán)辛二烯環(huán)C7 含羥基取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素質譜裂解規(guī)律 五味子醇甲是環(huán)辛二烯環(huán)C7 含羥基取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素類化合物，由于C7 位羥基易發(fā)生中性丟失一分子HO 形成較為穩(wěn)定的環(huán)辛三烯環(huán)結構，較五味子甲素、五味子乙素等環(huán)辛二烯環(huán)結構穩(wěn)定，因此基峰為

m/z

384，369 等完整環(huán)辛二烯環(huán)結構，而非C6-C7 和C8-C9 鍵斷裂、重排氫后的六元芳環(huán)結構，如

m/z

346，328 等。其具體的質譜裂解行為見圖4。

圖4 五味子醇甲MS/MS 圖和質譜裂解途徑Fig 4 MS/MS spectrum and fragmentation pathway of schisandrin

綜上，聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素由于母核中多甲氧基的存在，會中性丟失1 個或多個中性甲基或殘基。環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的化合物的主要碎裂特點是C6-C7 和C8-C9 位置的跨環(huán)斷裂、并重排氫形成穩(wěn)定的六元芳環(huán)為基峰，而環(huán)辛二烯環(huán)C7 含羥基取代化合物基峰則為C7 位羥基中性丟失一分子HO 形成穩(wěn)定的環(huán)辛三烯環(huán)結構。

3.2 基于MS/MS 關聯(lián)的分子網絡分析五味子成分類別

在對五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲對照品質譜裂解規(guī)律總結的基礎上，進一步運用基于MS/MS 關聯(lián)的分子網絡鑒定五味子化學成分。分別使用五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲對照品作為“種子”節(jié)點，被標記為粉紅色。基于MS/MS 碎片模式的相似性，發(fā)現(xiàn)五味子中化學成分分別以“種子”節(jié)點被聚為兩類，其中以“種子”節(jié)點五味子甲素和五味子乙素為主要簇類別的可能為環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的化合物，而以“種子”節(jié)點五味子醇甲為主要簇類別的可能為環(huán)辛二烯環(huán)C7含羥基取代的化合物。進一步通過MS/MS 碎片及與“種子節(jié)點”的質量差異進行注釋，與“種子”節(jié)點相關且被鑒定的成分的被標記為綠色（見圖5）。

圖5 正離子模式下五味子提取物MS/MS 關聯(lián)的分子網絡圖Fig 5 Molecular network of MS/MS correlation of Schisandra chinensis extract in positive ion mode

將鑒定的成分進一步作為“種子”進行其他未知成分的鑒定和推測，最終在五味子中共鑒定到木脂素類化合物31 種（如表1 和圖6 所示）。這些木脂素類化合物大多數(shù)為正離子模式所鑒定，戈米辛D 及戈米辛H 通過負離子模式實現(xiàn)鑒定。所鑒定的化合物出峰時間均在30 min 以后，推測原因為，該類成分是低極性的脂溶性化合物，30 min 之前的峰大多為五味子中的有機酸、烯烴類成分。下面具體闡釋化合物鑒定的過程。

表1 UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS 鑒別五味子提取物中化學成分
Tab 1 Identification of compounds in extract based on UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS

編號電離模式間/min分子式理論分子量保留時實測分子量質量誤差碎片離子信息（豐度比/%）鑒定化合物1＋ 33.410 C23H30O7418.1989 418.19920.59 332.1248（89.54）；370.1770（100）；401.1955（32.46） 戈米辛S 2*＋ 35.590 C23H30O7418.1988 418.19920.81 300.0975（0.59）；332.1236（3.85）；370.1766（100）；401.1955（23.28）；402.1982（3.62）；419.1956（2.90）戈米辛S 同分異構體1 3*＋ 41.450 C23H30O7418.1988 418.19920.94 201.0909（100）；338.1457（7.16）；370.1731（9.91）；401.1898（3.34）；419.2383（3.02）戈米辛S 同分異構體2 4*＋ 43.670 C23H30O7418.1988 418.19920.80 316.1289（33.87）；332.1250（69.95）；370.1772（67.57）；401.1975（8.27）；419.1848（100）戈米辛S 同分異構體3 5＋ 32.796 C24H32O8448.2095 448.20970.44 342.1457（100）；358.1402（30.34）；373.1641（43.64） 戈米辛Q 6＋ 40.024 C22H28O6388.1881 388.18861.18 227.0700（54.70）；231.1006（1.37）；287.0911（100）；288.0981（44.56）；301.1062（12.71）；357.1688（17.16）戈米辛J 7*＋ 49.804 C22H28O6388.1882 388.18861.06 91.0547（19.95）；371.1851（100）；388.3934（19.90）；332.1037（1.02）；389.3966（9.38）戈米辛J 同分異構體8＋ 37.660 C22H26O6386.1725 386.17291.21 299.0913（53.15）；323.1274（71.28）；331.1169（21.56）；355.1535（100）；387.1790（20.33）（＋）-戈米辛M1 9＋ 39.010 C22H26O6386.1725 386.17291.16 299.0906（36.59）；331.1158（21.50）；355.1531（100）；387.1725（37.49）（＋）-戈米辛M2 10*＋ 40.250 C22H26O6386.1724 386.17291.29 299.0905（39.25）；331.1263（31.13）；355.1534（100）；387.1786（19.40）（＋）-戈米辛M同分異構體1 11*＋ 40.730 C22H26O6386.1724 386.17291.29 299.0913（26.35）；310.1555（100）；331.1589（6.48）；355.1470（30.06）；387.1793（15.76）（＋）-戈米辛M同分異構體2

續(xù)表1

注（Note）：對照品（reference substance）；首次檢定（first identification）。

編號電離模式間/min分子式理論分子量保留時實測分子量質量誤差碎片離子信息（豐度比/%）鑒定化合物12*＋ 48.770 C22H26O6386.1724 386.17291.29 171.0799（55.46）；227.0699（21.23）；285.0750（100）；299.0896（14）；355.1536（16.47）；387.1799（20.29）（＋）-戈米辛M同分異構體3 13＋ 39.503 C22H24O7400.1517 400.15221.21 165.0546（100）；341.1016（34.90）；370.1784（48.40）；383.1476（9.27）；401.1963（17.17）戈米辛 R 14＋ 44.360 C24H30O7430.1988 430.19920.80 341.1378（45.04）；356.1615（100）；372.1561（49.26）；387.1796（28.80）methylisogomisin O 15*＋ 43.850 C24H30O7430.1989 430.19920.66 356.1614（100）；358.1401（15.19）；372.1562（46.63）；387.1796（28.49）methylisogomisin同分異構體16＋ 47.164 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；342.1089（53.28）；371.1484（1.90）；373.1274（29.73）neoisostegane 17*＋ 44.840 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；342.1084（56.23）；371.1485（62.33）；373.1274（34.99）neoisostegane 同分異構體1 18*＋ 45.200 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1301（100）；341.1374（75.99）；356.1248（78.05）；371.1485（61.78）；373.1276（48.80）neoisostegane 同分異構體2 19*＋ 45.624 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1302（100）；341.1367（77.54）；356.1243（72.30）；371.1478（59.95）neoisostegane 同分異構體3 20*＋ 46.320 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1296（100）；342.1085（60.87）；371.1479（64.97）；373.1268（28.36）neoisostegane 同分異構體4 21*＋ 47.961 C23H26O7414.1673 414.16791.23 340.1296（100）；343.1165（58.17）；366.1452（64.92）；385.1633（54.18）neoisostegane 同分異構體5 22＋ 43.743 C28H36O8500.2402 500.24101.69 83.0497（84.55）；318.1093（2.08）；332.1249（75.81）；370.1770（100）propinquanin F 23＋ 41.189 C27H34O8486.2250 486.22540.81 83.0496（100）；219.1017（35.21）；295.1324（23.77）；313.1067（32.67）；355.1534（50.03）24＋ 35.023 C22H24O6384.1570 384.15730.85 191.1060（2.29）；219.1015（23.90）；247.0963（100）；339.1588（76.93）；385.1598（5.62）schisantherin F五味子素 C 25＋ 44.107 C22H24O6384.1570 384.15730.83 312.0987（25.20）；316.0938（100）；329.1012（20.32）；355.1533（84.20）；385.1613（32.89）五味子素 C 同分異構體1 26＋ 47.173 C22H24O6384.1570 384.15730.83 313.1050（34.81）；328.1295（61.71）；329.1337（7.14）；354.1446（28.77）；385.1630（100）五味子素 C 同分異構體2 27－ 36.238 C28H34O10530.2156 530.21520.74 209.1168（100）；435.2162（69.98）；453.2265（40.38） 戈米辛 D 28－ 40.820 C23H30O7418.1841 418.18351.39 181.0858（5.79）；309.1481（34.87）；310.1556（60.24）；369.1692（100）；387.1798（20.15）戈米辛 H 29#＋ 41.570 C24H32O6416.2193 416.21991.45 316.1294（100）；301.1060（29.02）；347.1478（21.82）；402.2023（24.70）五味子甲素30#＋ 43.770 C23H28O6400.1880 400.18861.53 300.0980（100）；301.1047（46.03）五味子乙素31#＋ 38.460 C24H32O7432.2139 432.21482.15 346.1405（65.02）；369.1691（66.18）；384.1925（100）；342.1454（35.09）五味子醇甲

圖6 五味子提取物在正離子模式下的總離子流圖Fig 6 Total ion chromatogram of Schisandra chinensis extract in positive ion mode

3.2.1 環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素鑒定 峰8 精確分子量為

m/z

386.1729，推測其元素組成為CHO（質量誤差1.21）。在MS/MS 出現(xiàn)

m/z

355，331，323，299 等碎片離子（見圖7）。其中碎片離子

m/z

331 和299 分別與碎片離子

m/z

387 和355 相差56 Da，其碎裂行為符合環(huán)辛二烯環(huán)丟失CH碎片離子形成穩(wěn)定六元環(huán)結構的裂解規(guī)律。由此推測該化合物是環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素類化合物，而峰8 的精確分子量相較于五味子乙素相差一個亞甲基官能團，結合文獻報道，推測化合物8 為（＋）-戈米辛M1。

圖7 峰8（戈米辛M1）的MS/MS 圖Fig 7 MS/MS diagram of peak 8（gomisin M1）

同理，根據高分辨質譜精確分子量（質量誤差≤5）的提取離子色譜（XIC）以及數(shù)據依賴性掃描的多級質譜（MS/MS）發(fā)現(xiàn)，與對照品五味子甲素（CHO）和五味子乙素（CHO）具有相似碎裂特征的化合物還有9 個，分別為峰6、7、9、10、11、12、24、25、26。這些化合物在MS/MS 質譜圖中，其碎片離子差均出現(xiàn)?56 Da（環(huán)辛二烯環(huán)的跨環(huán)碎裂丟失CH）的碎片特征。由此推斷這9 個化合物均為環(huán)辛二烯環(huán)無含氧取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素。結合文獻，根據保留時間和MS/MS 碎片分別鑒定這些化合物結構為戈米辛J 及其同分異構體、（＋）-戈米辛M2 及戈米辛M 同分異構體1/2/3、五味子素C 及五味子素C 同分異構體1/2，而7、10、11、12 號化合物為該植物首次鑒定。

3.2.2 環(huán)辛二烯環(huán)C7 含羥基取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素鑒定 峰1 精確分子量為

m/z

418.1992，推測其元素組成為CHO（質量誤差0.59）。在MS/MS 碎片中發(fā)現(xiàn)[M ＋H-HO]峰（

m/z

401）較為顯著（見圖8），與對照品五味子醇甲（CHO）的質譜裂解規(guī)律類似，推測可能為環(huán)辛二烯環(huán)C7 位羥基中性丟失一分子HO 形成穩(wěn)定的環(huán)辛三烯環(huán)結構。另外，峰1 從精確分子量較于五味子醇甲相差一個亞甲基官能團，結合文獻報道，推測化合物1 號為戈米辛S。

圖8 峰1（戈米辛S）的MS/MS 圖Fig 8 MS/MS diagram of peak 1（gomisin S）

同理，根據高分辨質譜精確分子量（質量誤差≤5）的提取離子色譜（XIC）以及數(shù)據依賴性掃描的多級質譜（MS/MS）發(fā)現(xiàn)，1、2、3、4、13、22、23、28 等化合物的裂解特征均為中性丟失一分子HO 形成穩(wěn)定的碎片離子。由此推斷這8 個化合物均為環(huán)辛二烯環(huán)C7 含羥基取代的聯(lián)苯環(huán)烯型木脂素。其中根據對照品五味子醇甲以及文獻和保留時間、MS/MS 碎片分別鑒定1、2、3、4、13、22、23、28 化合物結構為戈米辛S 及其同分異構體1/2/3、戈米辛R、propinquanin F、schisantherin F、戈米辛H。其中化合物2 ～4號化合物為該植物首次鑒定。

4 結論

本研究采用簡單的前處理同時結合UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS 和分子網絡技術，建立了一種快速篩查和鑒定中藥五味子中聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類化學成分的分析方法。根據所獲得的精確分子質量、碎片離子等信息，結合對照品信息和相關文獻，共鑒定出31 種聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類化合物，其中有13 個成分為首次在五味子中檢出。本研究進一步豐富和細化了五味子有效成分信息特征，為五味子化學成分的分析提供一定參考，為五味子中聯(lián)苯環(huán)辛二烯型木脂素類成分的物質基礎研究提供依據。

本研究擬采用UHPLC Q-Exactive Orbitrap MS/MS 和分子網絡技術對五味子成分進行快速篩查和深度鑒定，并解析其可能存在的新成分，以形成一套較為完整的成分表征策略，為化合物的物質基礎分析提供方法學參考。