煙管頭草的化學成分及其細胞毒活性

馮樹慧，張衛青，孫 茂，郭洪位，孫貴萍，朱成光，王天元*，晏 晨*

1貴州中醫藥大學，貴陽 550002；2安順市人民醫院，安順 561000

煙管頭草(Carpesiumcernuum)為菊科(Asteraceae)天名精屬(CarpesiumL.)多年生草本，主要分布在東北、華北、華中、華東、華南、西南各省及西北陜西、甘肅等地，特別是我國四川、貴州等山區資源豐富，生于路邊荒地及山坡、溝邊等處。煙管頭草在民間用于治療帶狀皰疹、流行性腮腺炎、口腔糜爛、三叉神經痛、毛囊炎、扁平疣、流行性急性病毒性結膜炎、毒蛇咬傷等疾病[1]。天名精屬植物中主要含有倍半萜、單萜、二萜、三萜、酚類、黃酮類、香豆素、木脂素、甾體等類型的化合物[2,3]。其中以倍半萜類化合物最具代表性，也是該屬植物中報道最多且廣泛存在的成分[4-6]。現代藥理學研究表明，該屬植物具有抗腫瘤、抑菌、抗炎、殺蟲和細胞毒活性等藥理作用[7]。前期本課題組對煙管頭草進行了化學成分研究，發現了5個新的倍半萜類化合物[8,9]，并對分離得到的化合物進行抗白血病[9]、抗前列腺癌[10-12]等活性研究，結果表明它們可通過抑制相關信號通路進而抑制癌細胞增殖。為了獲得生物活性更好的化合物，本課題對煙管頭草95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物繼續進行化學成分研究，并對分離得到的化合物進行細胞毒活性測試，為天名精屬植物的開發利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

INOVA-400 MHz和INOVA-500 MHz超導核磁共振波譜儀(美國瓦里安公司)，TMS為內標；Waters 1525 EF高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Waters 2998檢測器，Waters SunFire色譜柱為C18(10 mm×250 mm，4.6 mm×150 mm)；JASCO P-1020旋光儀(日本JASCO公司)；Shimadzu UV-2401A紫外光譜儀(日本Shimadzu公司)；Bruker Tensor-27紅外光譜儀(德國Bruker公司)；Bruker HCT/Esquire和Waters Autospec Premier P776質譜儀(德國Bruker公司，美國Waters公司)；Sephadex LH-20(日本三菱化學公司)；RP-18反相硅膠(日本YMC公司)；柱層析硅膠(200～300目和300～400目，青島海洋化工廠)；硅膠GF254薄層板(50 mm×100 mm，0.20～0.25 mm，青島海洋化工廠)；分析純三氯甲烷、丙酮(重慶川東化工集團有限公司)；其余試劑均從工業級蒸餾中獲得；5%硫酸乙醇顯色劑。

實驗所用煙管頭草藥材于十月份采自貴州省安順市鎮寧縣，經貴州中醫藥大學孫慶文教授鑒定為煙管頭草(Carpesiumcernuum)，標本(Assrmyy201608)保存于貴州省安順市人民醫院藥學實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取與分離

取干燥煙管頭草全草20.0 kg，粉碎，用95%的工業乙醇加熱回流提取3次(3 h/次)，將提取液合并，濃縮回收乙醇。然后加水使濃縮液呈懸浮狀態，乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取液與水層，乙酸乙酯萃取物960.0 g進行硅膠柱層析(300～400目)，以石油醚-丙酮(60∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫，得到7個餾分(Fr.1～7)。

Fr.1(133.0 g)經正相硅膠柱(300～400目)，以石油醚-乙酸乙酯(60∶1→1∶1，V/V)梯度洗脫，得到4個亞餾分(Fr.1a～1d)。亞餾分1b(15.2 g)用Sephadex LH-20(CHCl3∶MeOH，V/V=1∶1)純化，并用正相硅膠柱(石油醚-乙酸乙酯，15∶1)進一步純化，得到化合物2(325.6 mg)和3(95.4 mg)。亞餾分1d(2.8 g)經正相硅膠柱(300～400目)，以石油醚-乙酸乙酯(30∶1→5∶1，V/V)梯度洗脫，并用制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)進一步純化，分離得到化合物1(11.6 mg)和7(8.0 mg)。Fr.2(82.4 g)經硅膠、Sephadex LH-20、反相RP-18柱層析反復分離，并經制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)進一步純化得到化合物4(42.6 mg)、5(19.2 mg)和6(8.5 mg)。Fr.3(102.0 g)經反相RP-18柱層析，以甲醇-水系統(40%∶60→100∶0，V/V)梯度洗脫，再經制備型高效液相色譜(乙腈∶水，V/V=60∶40)分離純化后得到化合物8(5.0 mg)、9(6.3 mg)和10(9.5 mg)。

1.2.2 細胞毒活性

采用MTT法對人乳腺癌細胞MDA-MB-231進行細胞毒活性。化合物分別用DMSO溶解后配成30 mmol/L的儲備液，使用之前稀釋到適宜濃度。將MDA-MB-231細胞配制成細胞懸液接種于96孔板上(100 μL/孔)，實驗分為陽性對照組和四個給藥組，接種好的細胞培養板放入培養箱中培養24 h后分別加入1.25、2.5、5、10 μmol/L的含藥樣品溶液各10 μL，在5% CO2，37 ℃孵育72 h后，每孔加入10 μL配制好的MTT溶液(5 mg/mL，即0.5% MTT)繼續培養4 h，孵育后使用酶標儀測量在波長為490 nm下的吸光度(A)，并計算IC50值。紫杉醇為陽性對照。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1～10的化學結構如圖1所示。

圖1 化合物1～10的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

通過二維核磁1H-1H COSY、HSQC、HMBC譜對化合物的碳氫信號進行了全歸屬，其詳細數據見表1。化合物1的1H-1H COSY(見圖2)表明結構中存在三個連續的片段H-3/H-4/H-5、H-7/H-8/H-9/H-10/H-17、H-17/H-10/H-11/H-12/H-13，基于1H-1H COSY片段H-3/H-4/H-5，HMBC相關H-4到C-2、3、5、6說明C-5與C-6之間為雙鍵，C-2為酮羰基；同時，C-2與H-1、3、4存在相關性，可知C-1為與C-2直接相連的甲基；結合H-7/H-8/H-9/H-10/H-17片段，由HMBC譜中H-7到C-5、6、8、9、18相關，參考DEPT譜，說明C-7/C-8/C-9為三個直接相連的亞甲基片段以及確定了C-5、6、7、18的連接方式；此外，在HMBC譜中，H-18與乙酰氧基中的酯羰基碳原子、甲基碳原子有相關，乙酰氧基中的甲基質子與C-18有相關，可判斷乙酰氧基連接在C-18位上；根據H-17/H-10/H-11/H-12/H-13片段，由HMBC譜中H-10到C-9、11、17和H-12到C-10、11、13、14相關，說明了C-9、10、11、12、13、14、17的連接方式；H-15和H-16與C-13、C-14存在相關性，說明兩個甲基C-15、C-16與C-14直接相連。ROESY相關峰H-4/H-18及H-5/H-7表明C-5與C-6之間的雙鍵構型為Z。化合物1的絕對構型還有待確認[13]。化合物1與(2E,6Z,10E,12R)-7-[(acetyloxy)methyl]-3,11,15-trimethylhexadeca-2,6,10,14-tetraene-1,12-diol的1H NMR和13C NMR數據[14]相似，表明兩個化合物具有相似的分子骨架，兩者的區別在于化合物1比已知化合物少了2個雙鍵、1個羥基和2個亞甲基，但化合物1多了1個羰基。因此確定化合物1為(5Z)-6-[(acetyloxy)methyl]-2-oxo-2,10,14-trimethylhexadeca-5,13-diene-11α-ol。化合物1的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數據Table 1 1H (400 MHz) and 13C (100 MHz) NMR dataof compound 1 ( in CDCl3,δ in ppm,J in Hz)

圖2 化合物1的1H-1H COSY、HMBC和ROESY主要相關信號Fig.2 Key 1H-1H COSY,HMBC and ROESY correlations signal of compound 1

化合物2黃色油狀物；C22H38O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.41(1H，m，H-2)，5.40(1H，m，H-10)，5.17(1H，m，H-14)，4.58(2H，s，H-18)，4.13(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1)，3.40(1H，m，H-12)，2.06(3H，s，H-2′)，1.74(3H，s，H-16)，1.66(3H，s，H-20)，1.65(3H，s，H-17)，0.90(3H，d，J= 6.8 Hz，H-19)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.2(C-1)，124.1(C-2)，138.4(C-3)，39.4(C-4)，25.8(C-5)，32.5(C-6)，38.0(C-7)，31.5(C-8)，25.8(C-9)，130.3(C-10)，135.2(C-11)，75.5(C-12)，35.4(C-13)，120.5(C-14)，134.1(C-15)，25.9(C-16)，17.9(C-17)，61.8(C-18)，15.4(C-19)，16.2(C-20)，171.2(C-1′)，20.9(C-2′)。以上數據與文獻[15]報道數據一致，故鑒定化合物為(2E,10E)-1,12-dihydroxy-18-acetoxy-3,7,15-trime-thylhexadeca-2,10,14-triene。

化合物3黃色油狀物；C22H36O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.42(1H，t，J= 7.2 Hz，H-2)，5.40(1H，t，J= 6.8 Hz，H-6)，5.38(1H，t，J= 7.2 Hz，H-10)，5.08(1H，t，J= 7.2 Hz，H-14)，4.59(2H，s，H-19)，4.14(2H，d，J= 6.8 Hz，H-1)，3.97(1H，t，J= 6.4 Hz，H-12)，2.07(3H，s，H-AcO)，1.72(3H，s，H-16)，1.64(3H，s，H-17)，1.63(3H，s，H-20)，1.62(3H，s，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.3(C-1)，124.0(C-2)，137.2(C-3)，39.3(C-4)，26.1(C-5)，130.4(C-6)，133.6(C-7)，34.7(C-8)，25.9(C-9)，125.3(C-10)，137.3(C-11)，77.0(C-12)，34.7(C-13)，120.1(C-14)，134.7(C-15)，25.8(C-16)，18.0(C-17)，11.8(C-18)，61.9(C-19)，16.2(C-20)，20.0(CH3-AcO)，171.2(COO-AcO)。以上數據與文獻[14]報道數據一致，故鑒定化合物為(2E,6Z,10E,12R)-7-[(acetyloxy)methyl]-3,11,15-trimethylhexadeca-2,6,10,14-tetraene-1,12-diol。

化合物4無色油狀物；C22H38O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.40(1H，br t，J= 7.1 Hz，H-2)，5.38(1H，br t，J= 6.8 Hz，H-6)，5.17(1H，d，J= 6.8 Hz，H-14)，4.13(2H，d，J= 7.1 Hz，H-1)，3.40(1H，m，H-12)，2.22(2H，m，H-5)，2.12(2H，m，H-13)，2.08(2H，m，H-4)，1.99(1H，m，H-9α)，1.76(3H，brs，H-16)，1.67(3H，br s，H-20)，1.65(3H，brs，H-17)，1.55(1H，m，H-11)，1.49(1H，m，H-10α)，1.30(1H，m，H-9β)，1.13(1H，m，H-10β)，0.89(1H，d，J= 6.8 Hz，H-18)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：59.2(C-1)，124.1(C-2)，137.5(C-3)，39.3(C-4)，25.8(C-5)，130.2(C-6)，133.9(C-7)，35.4(C-8)，25.4(C-9)，31.5(C-10)，38.0(C-11)，75.4(C-12)，32.4(C-13)，120.5(C-14)，135.3(C-15)，25.9(C-16)，17.9(C-17)，15.4(C-18)，61.8(C-19)，16.1(C-20)，20.9(CH3-AcO)，171.1(COO-AcO)。以上數據與文獻[16]報道數據一致，故鑒定化合物為(2E,6Z,11S,12R)-3,7,11,15-tetramethylhexadeca-2,6,14-triene-7-[(acetyloxy)methyl]-1,12,19-triol。

化合物5黃色油狀物；C20H34O2；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：5.27(1H，m，H-6)，5.14(1H，m，H-14)，5.07(1H，m，H-10)，3.93(2H，d，J= 7.2 Hz，H-1)，3.90(2H，s，H-18)，1.63(6H，s，H-16，H-17)，1.57(6H，s，H-19，H-20)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：57.9(C-1)，125.2(C-2)，135.3(C-3)，39.4(C-4)，25.5(C-5)，125.4(C-6)，139.2(C-7)，34.5(C-8)，26.2(C-9)，124.2(C-10)，130.6(C-11)，39.4(C-12)，26.2(C-13)，124.1(C-14)，134.2(C-15)，25.3(C-16)，16.0(C-17)，57.5(C-18)，17.6(C-19)，15.8(C-20)。以上數據與文獻[17]報道數據一致，故鑒定化合物為plaunotol。

化合物6黃色油狀物；C13H18O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：6.85(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.48(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，5.96(1H，d，J= 1.1 Hz，H-4)，2.52(1H，d，J= 17.2 Hz，H-2β)，2.33(1H，d，J= 18 Hz，H-2α)，2.31(3H，s，H-10)，1.88(3H，d，J= 1.4 Hz，H-11)，1.11(3H，s，H-13)，1.02(3H，m，H-12)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：41.4(C-1)，49.5(C-2)，197.4(C-3)，127.7(C-4)，160.3(C-5)，79.2(C-6)，144.9(C-7)，130.3(C-8)，196.9(C-9)，29.6(C-10)，18.6(C-11)，24.3(C-12)，22.9(C-13)。以上數據與文獻[18,19]報道數據一致，故鑒定化合物為S-(+)-dehydrovomifoliol。

化合物7白色粉末；C11H16O3；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.68(1H,S,H-6),4.32(1H,S,H-s),2.45(1H，dt，J= 14.2，2.6 Hz，H-3β)，1.98(1H，dt，J= 14.5，2.6 Hz，H-1β)，1.73-1.81(1H，m，H-3α)，1.77(3H，s，H-11)，1.51(1H，dd，J= 14.6，3.7 Hz，H-1α)，1.46(3H，s，H-9)，1.25(3H，d，J= 8.8 Hz，H-10)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：47.2(C-1)，66.6(C-2)，45.5(C-3)，86.8(C-4)，182.7(C-5)，112.7(C-6)，172.0(C-7)，35.9(C-8)，26.4(C-9)，30.61(C-10)，26.9(C-11)。以上數據與文獻[20,21]報道數據一致，故鑒定化合物為pubinernoid A。

化合物8白色針晶(氯仿)；mp.151～152 ℃；C29H48O；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，m，H-6)，5.15(1H，dd，J= 15.1,8.5 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J= 8.8 Hz，H-23)，3.52(1H，m，H-3)，1.01(3H，s，CH3-10)，0.82(3H，s，CH3-29)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.2(C-1)，29.1(C-2)，71.8(C-3)，42.2(C-4)，140.7(C-5)，121.7(C-6)，31.8(C-7)，31.9(C-8)，50.1(C-9)，36.5(C-10)，21.1(C-11)，39.7(C-12)，42.2(C-13)，56.8(C-14)，24.2(C-15)，28.9(C-16)，55.9(C-17)，12.0(C-18)，19.4(C-19)，40.5(C-20)，21.1(C-21)，138.3(C-22)，129.2(C-23)，51.2(C-24)，31.6(C-25)，18.9(C-26)，21.0(C-27)，25.4(C-28)，12.0(C-29)。以上數據與文獻[22,23]報道數據一致，故鑒定化合物為豆甾醇。

化合物9白色針晶(甲醇)；mp.187～188 ℃；C27H28N2O4；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.71(2H，d，J= 7.2 Hz，H-3′，H-7′)，7.53(1H，t，J= 7.2 Hz，H-5′)，7.44(2H，t，J= 7.6 Hz，H-4′，H-6′)，7.25(5H，m，H-5，H-9)，7.15(2H，m，H-5′′，H-7′′)，7.06(2H，d，J= 7.2 Hz，H-4′′，8′′)，6.80(1H，d，J= 7.6 Hz，H-βNH)，6.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-αNH)，4.78(1H，dd，J= 8.0，14.0 Hz，H-2)，4.34(1H，m，H-1′′)，3.92(1H，dd，J= 4.8，11.0 Hz，H-9′′β)，3.81(1H，dd，J= 4.0，11.2 Hz，H-9′′α)，3.21(1H，dd，13.6 Hz，J= 6.0，H-3β)，3.06(1H，dd，J= 8.4，13.6 Hz，H-3α)，2.75(2H，m，H-2′′)，2.02(3H，s，-COCH3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.2(C-1)，54.9(C-2)，38.4(C-3)，136.7(C-4)，128.6(C-5，C-9)，129.3(C-6，C-8)，127.1(C-7)，167.1(C-1′)，133.6(C-2′)，128.5(C-3′，7′)，127.0(C-4′，C-6′)，131.9(C-5′)，49.4(C-1′′)，37.4(C-2′′)，136.6(C-3′′)，128.7(C-4′′，C-8′′)，129.1(C-5′′,C-7′′)，126.7(C-6′′)，64.6(C-9′′)，20.8(CH3-COCH3)，170.8(C=O-COCH3)。以上數據與文獻[24,25]報道數據一致，故鑒定化合物為aurantiamide acetate。

化合物10白色針晶(甲醇)；mp.210～212 ℃；C9H8O3；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.52(1H，d，J=16.0 Hz，H-3)，7.49(2H，m，H-2′，H-6′)，6.78(2H，m，H-3′，H-5′)，6.28(1H，d，J= 16.0 Hz，H-2)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：167.9(C-1)，115.3(C-2)，125.2(C-3)，144.2(C-1′)，130.1(C-2′，C-6′)，115.7(C-3′，C-5′)，159.6(C-4′)。以上數據與文獻[26,27]報道數據一致，故鑒定化合物為反式對羥基肉桂酸。

2.2 細胞毒活性

本實驗對從煙管頭草中分離得到的化合物1～4進行細胞毒活性測試，結果顯示，與陽性對照紫杉醇(taxol，IC50= 0.10 μmol/L)相比，化合物2對人乳腺癌細胞MDA-MB-231表現出較強的細胞毒活性，其IC50值為6.80 μmol/L，化合物1、3、4表現出中等細胞毒活性，IC50值分別為34.89、46.13、30.38 μmol/L。

3 討論與結論

本文從煙管頭草全株95%乙醇提取物的乙酸乙酯萃取部位共分離和鑒定出10個化合物，包括單萜類、二萜類及其他類化合物，其中化合物1為新化合物。化合物5先前被日本學者研發為抗潰瘍藥普勞諾托，但其具體的有效部位尚未確定，提示在后期天名精屬化學成分活性研究中可以對分離得到的二萜類化合物進行抗潰瘍藥理活性研究。

對化合物1～4進行細胞毒活性測試表明，化合物2對人乳腺癌細胞MDA-MB-231表現出較強的細胞毒活性,其IC50值為6.80 μmol/L，化合物1、3、4表現出中等細胞毒活性。煙管頭草提取物對多種癌細胞的增殖均有抑制作用[28]，但在人乳腺癌細胞MDA-MB-231中IC50值最小，這為治療乳腺癌疾病提供了一定的藥理依據，提示煙管頭草提取物可作為抗乳腺癌藥物的潛在成分。綜合本課題組前期對煙管頭草中化學成分進行抗白血病[9]、抗前列腺癌[10-12]研究發現，其單體化合物可通過抑制相關信號通路進而抑制癌細胞增殖。因此，煙管頭草在抗腫瘤方面具有很大的研究前景，但目前藥理活性的研究主要集中在單體化合物的體外活性篩選，而體內藥效評價、作用機制及構效關系的研究甚少，可將量大的單體化合物進行體內藥效評價，這為抗腫瘤新藥的研發提供了重要的理論依據。