舒敏中藥提取物制備及其功效評價研究

王 領，董銀卯，張守文*

1國家藥品監督管理局高級研修學院，北京100073；2北京工商大學化學與材料工程學院，北京100048

常見的皮膚過敏反應在醫學上稱作超敏反應，又稱變態反應，是指機體受到某些抗原刺激時，出現以生理功能紊亂或組織細胞損傷為主的異常特異性免疫應答。其發生取決于兩個因素：抗原的刺激和機體的反應性，誘發過敏反應的抗原稱為過敏原[1]。皮膚產生過敏時會出現皮膚干燥、疼痛、瘙癢現象，嚴重時更可能伴有紅腫、皰疹等癥狀，給人們的日常生活帶來了很大影響。因此，舒敏類化妝品研發成為該領域研究熱點之一[2]。

2020年頒布的《化妝品監督管理條例》中提出：“國家鼓勵和支持化妝品生產經營者采用先進技術和先進管理規范，提高化妝品質量安全水平；鼓勵和支持運用現代科學技術，結合我國傳統優勢項目和特色植物資源研究開發化妝品”。這也是政府首次從法律層面提出利用特色植物資源研究開發化妝品，這將大大促進植物資源化妝品的研發和創新。

本文在前期單味中藥篩選的研究基礎上，將六味中藥運用中醫“君臣佐使”思想進行組方，具有抗病原微生物、消炎、解熱、鎮痛、增強免疫等作用[3]的香薷和具有清熱解毒功效[4]的山慈菇為“君藥”，起到抗敏、消腫止癢之功效；具有抗炎、鎮靜等藥理活性的獨活[5]為“臣藥”，起到抗炎殺菌之功效；可消腫止痛[6]的三棱和對皮膚無刺激性、抗氧化[7]，具有抗病原微生物藥理活性[8]的孩兒茶為“佐藥”，起到行氣止痛、快速修復皮膚之功效；遠志為“使藥”，起到調和藥性，提高皮膚屏障之功效。繼續研究組方提取制備工藝，驗證組方提取物舒敏功效，并探究其作用機理，以期為其在醫藥和化妝品領域中的應用提供理論依據和數據支撐，該組方提取物現已授權國家發明專利(專利號ZL202010224890.X)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用六味中草藥經原山東宏濟堂中藥研究院副院長、范圣此研究員基源鑒定，分別為香薷(Elsholtziaciliata(Thunb.) Hyland.干燥全株)、山慈菇(獨蒜蘭Pleionebulbocodioides(Franch.) Rolfe.干燥假鱗莖)、獨活(重齒毛當歸Angelicabiserrata(Shan et Yuan) Yuan et Shan干燥根)、三棱(黑三棱SparganiumstolonierumBuch.-Ham.干燥塊莖)、孩兒茶(Acaciacatechu(L.f.) Willd.干燥去皮枝)、遠志(PolygalatenuifoliaWilld.干燥根)。

透明質酸酶(Sigma，貨號：H3884)；透明漢生膠(Maya，貨號：NZJ-132)；1,3-丁二醇(Aladdin，貨號：B111018)；EDTA-2Na(Clariant，批號：12101528)；透明質酸鈉(華熙生物，批號：20022543)；海藻糖(Hayashibara，批號：12091330)；合成角鯊烷(西安康諾化工有限公司，批號200312A)；棕櫚酸乙基己酯(Basf，批號：19040153)；辛酸/癸酸甘油三酯(Croda，批號：mct600421)；辛酰羥肟酸、1,2-乙二醇、1,3-丙二醇(廣州華良化工有限公司，批號：191125-32)；硬脂酸甘油酯/PEG-100硬脂酸酯(昆山晟安生物科技有限公司，批號：19060855)；甘油葡糖苷(湖北漢達飛生物科技有限公司，批號：1207698)；甘草酸二鉀(億利耐雀生物科技有限公司，批號：18020201)；六味中藥材(北京同仁堂)；組方提取物(自制)、去離子水(自制)等。

1.2 儀器

AL104電子天平(梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司)；HH-S6/ZK6電熱恒溫水浴鍋(鞏義市予華儀器有限責任公司)；T18 digital剪切分散機、EUROSTAR 200 digital懸臂攪拌機(德國IKA公司)；VISIA面部圖像分析儀(美國Canfield公司)；Cutometer MPA 580(Tewameter TM300、Corneometer CM825、Mexameter MX18、Skin-pH meter pH905)(德國Courage + Khazaka公司)；N4S 紫外可見分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；8 mm(20 μL)聚丙烯涂層(PP Coated)斑試器(上海攬寶公司)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 中藥組方提取物制備

按質量比稱取中藥，香薷∶山慈菇∶獨活∶三棱∶孩兒茶∶遠志=6∶5∶2∶2∶1∶1，6味中藥共100 g，經粉碎機粉碎，取粒度為40～100 目的中藥顆粒50 g，加入15倍70%乙醇，60 ℃回流提取150 min；提取完成后將混合物冷卻至35 ℃，過濾除去濾渣，濾液稱重后，加入0.8%～1%的活性炭脫色，55～60 ℃脫色60～80 min，過濾除去活性炭，取濾液備用；將濾液在0.08 Mpa，40～45 ℃條件下進行減壓濃縮，至浸膏狀無明顯乙醇味，得到中藥提取物浸膏；將中藥提取物浸膏與1,3-丁二醇(充當溶劑作用)按質量比例為1∶50混合，充分攪拌溶解后過濾，得到組方提取物。

1.3.2 組方舒敏乳的制備

化妝品配方設計見表1。

表1 舒敏乳組方Table 1 The formulation of cosmetic emulsions

續表2(Continued Tab.2)

制備工藝：稱取A相各物質，混合并充分分散后，升溫至85 ℃，保溫30 min，備用；稱取B相各物質，混合并加熱至75 ℃，完全溶解并攪拌均勻，備用；將B相加入到A相中，乳化3 min，乳化速度為3 000～4 000 rpm；將乳化后的料體緩慢攪拌降溫，至45 ℃加入C相各物質，攪拌均勻；料體冷卻至室溫，出料灌裝。

1.4 組方提取物功效評價

1.4.1 透明質酸酶活性抑制實驗[9]

實驗濃度分別采用1.0%、2.0%、4.0%、6.0%、8.0%(組方提取物在體系中的質量百分比)來測定組方提取物對透明質酸酶活性抑制效果。

1.4.1.1 所需溶液配制

醋酸緩沖溶液：量取1.155 mL冰乙酸稀釋至100 mL混勻，取其中4.8 mL為A溶液；稱取2.72 g乙酸鈉結晶，加水溶解定容至100 mL混勻，取其中45.2 mL為B溶液；混合A、B溶液，以水定容至100 mL，混勻。

透明質酸酶溶液：稱取10 mg透明質酸酶于燒杯中，加入4 mL醋酸緩沖溶液，搖勻備用。

透明質酸鈉溶液：稱取5 mg透明質酸鈉于燒杯中，加入10 mL醋酸緩沖溶液，搖勻備用。

埃爾利希試劑(Ehrlich reagent)：稱取0.8 g對-二甲氨基苯甲醛，溶于15 mL濃鹽酸和15 mL無水乙醇中。

乙酰丙酮溶液：取3.5 mL乙酰丙酮，溶于50 mL 1.0 mol/L的碳酸鈉溶液中，用前配制。

1.4.1.2 實驗方法

取0.25 mmol/L的CaCl2溶液0.1 mL和透明質酸酶溶液0.5 mL，37 ℃保溫培養20 min；加入不同濃度的組方提取物0.5 mL，繼續37 ℃保溫培養20 min；加入0.5 mL透明質酸鈉液37 ℃保溫30 min，常溫放置5 min；加入0.1 mL 0.4 mol/L NaOH溶液和0.5 mL乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加熱15 min，立即用冰水冷卻5 min；加入埃爾利希試劑1.0 mL，并用3.0 mL無水乙醇進行稀釋，放置顯色20 min，期間對試樣進行450～700 nm范圍的波長掃描，確定最大吸收波長，在最大吸收波長處用分光光度計測定其吸光度值。樣品對透明質酸酶抑制率的計算公式如下：

式中：A1為參比溶液吸光值，用去離子水代替所得試樣；A2為參比空白溶液吸光值，用去離子水代替所得試樣，用醋酸緩沖溶液代替透明質酸酶和透明質酸鈉溶液；B1為試樣溶液吸光值；B2為試樣空白溶液吸光值，用醋酸緩沖溶液代替透明質酸酶和透明質酸鈉溶液。

1.4.2 自由基清除實驗

1.4.2.1 清除DPPH自由基實驗[10]

準確稱取20 mg DPPH，用無水乙醇定容至250 mL，得到濃度為20 mmol/L的DPPH·溶液，將組方提取物分別用去離子水稀釋成不同濃度的測試液。取2 mL測試液和2 mL 20 mmol/L DPPH·溶液混勻，反應30 min，測定517 nm波長下吸光度的變化，對照溶劑用無水乙醇代替。樣品對DPPH自由基清除率的計算公式如下：

式中：A1為2 mL DPPH·溶液與2 mL不同濃度的組方提取物組成的混合液的吸光度；A2為2 mL DPPH·溶液與2 mL無水乙醇組成的混合液的吸光度；A3為2 mL不同濃度的組方提取物與2 mL無水乙醇組成的混合液的吸光度。

1.4.2.2 清除超氧陰離子自由基實驗[11]

取0.05 mol/L pH 8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，于25 ℃水浴中放置20 min，分別加入1 mL不同濃度組方提取物溶液和25 mmol/L的鄰苯三酚溶液0.4 mL，混勻后于25 ℃水浴中反應5 min，加入8 mol/L的HCl溶液1.0 mL終止反應，以Tris-HCl緩沖液作參比，在299 nm處測定吸光值，計算清除率?？瞻讓φ战M以1 mL試樣溶劑代替樣品，每個處理均做三個重復。樣品對超氧陰離子自由基清除率的計算公式如下：

式中：A1為空白的平均吸光度；A2為組方提取物的平均吸光度。

1.4.2.3 清除羥基自由基實驗[12]

羥基自由基由Fenton反應產生，·OH氧化水楊酸產生對510 nm有特征吸收的2,3-二羥基苯甲酸，通過測定水楊酸捕獲·OH所得到的產物確定·OH的清除率。在25 mL比色管中加入2 mmol/L FeSO4和1 mmol/L H2O2各3 mL，搖勻，再加入6 mmol/L 水楊酸3 mL，搖勻，于37 ℃水浴加熱15 min后取出，測其吸光度A1。然后分別加入不同濃度的組方提取物1mL，搖勻，繼續水浴加熱15 min，取出測其吸光度A2。

樣品對羥自由基清除率的計算公式：

其中：A1為空白的平均吸光度；A2為組方提取物的平均吸光度。

1.4.3 抑制KU812細胞中組胺釋放實驗[13]

人外周血嗜堿性(KU812)細胞常被用作研究過敏反應的效應細胞，其與人體肥大細胞具有很大的相似性，適合用于建立人類肥大細胞激活和脫顆粒模型。實驗采用KU812細胞組胺釋放模型，考查組方提取物對KU812細胞組胺釋放的影響。

1.4.3.1 樣品配制及處理

以DMSO配制組方提取物溶液，母液濃度為50 mg/mL，用時以含10%胎牛血清培養基稀釋，高、中、低濃度為1 000、500、250 μg/mL。

1.4.3.2 細胞培養及模型建立

用含10%胎牛血清的IMDM培養基進行稀釋細胞，將細胞密度調整為2.2×106個/mL，然后將得到的細胞懸液，接種于96孔板中，每孔接種量為180 μL。分為模型對照組、組方提取物高、中、低劑量組、空白對照組、每組設6個復孔，37 ℃、5%CO2培養箱培養靜置10 min，受試樣品組分別加入相應濃度劑量的組方提取物溶液20 μL(終濃度分別為200、100、50 μg/mL)，空白對照組和模型對照組分別加入20 μL培養液，置培養箱中預溫孵，2 h后除細胞空白對照組外，各組細胞加入刺激劑40 nM巴豆醇、12-十四烷酸酯-13-乙酸酯(PMA)、1 μm鈣離子載體A23187，PMA和A23187使用DMSO配制?？瞻讓φ战M加入同體積含等濃度DMSO培養基。

1.4.3.3 指標檢測

2 h后離心分離細胞，收集細胞上清液，測定上清液中組胺含量。

1.5 組方舒敏乳功效評價

化妝品的功效宣稱應當有充分的科學依據，功效宣稱依據包括文獻資料、研究數據或者化妝品功效宣稱評價試驗結果等。

1.5.1 功效評價實驗方案

參照GB17149-1997《化妝品皮膚病診斷標準及處理原則總則》，選取無診斷相關者。挑選符合篩選的受試者為試驗對象，在鼻唇溝和左側面頰部局部應用10%乳酸溶液，相應的對照組用去離子水。鼻唇溝處角質層通透性較高，附屬器官及神經網絡豐富，刺痛感較明顯。在2.5 min及5 min時對受試者的瘙癢、刺痛、灼痛感的不適程度進行四分法評定。刺痛程度(無：0；輕微：1；中度：2；重度：3)。如果兩次試驗之和大于或等于3，則可判定受試者是刺痛敏感個體，屬于敏感性皮膚，將其納入功效評價受試人員名單，預計納入30人。試者每日早中晚清潔皮膚后凃組方舒敏乳于面部，早晚各1次。使用樣品第7天、14天、21天回訪，記錄數據及使用效果。

1.5.2 數據分析

應用 SPSS軟件對各個測量值進行描述性統計，包括數量、均值、標準差等。所有指標數據，進行配對t檢驗，分析使用產品前后皮膚參數是否具有顯著性差異。

1.5.3 皮水分散失量測試

通過經皮水分散失速率測試探頭(Tewameter TM300&MPA 580)進行測試，分析皮膚表面水分蒸發的速率(Tewl)。

1.5.4 皮膚角質層含水量測試

通過角質層水分含量測試探頭(Corneometer CM825&MPA 580)進行測試。可以分析皮膚表面的含水量(C.U.)。

1.5.5 皮膚舒緩測試

通過皮膚黑色素和血紅素測試儀(Mexameter MX18&MPA 580)進行測試，通過測試皮膚與受試物接觸后的紅斑指數，能夠間接反映皮膚的過敏程度，評價護膚品對皮膚炎癥的改善情況。

1.5.6 抗敏修復測試

在納入功效評價名單中，隨機選取16名志愿者，前臂內側皮膚作為受試部位，在每個斑試器內加入質量分數為10%的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，貼于受試者左前臂內側皮膚，受試5 h，取下斑試器，半小時后觀察皮膚變化，并記錄；取25 μL舒敏乳加入斑試器中，空白對照為25 μL生理鹽水，然后將各斑試器貼敷于受試部位。試驗時間為 24 h，在斑試器貼敷24 h后去除，等待30 min 后觀察并記錄試驗結果。48 h時后再觀察一次，記錄測試結果。

2 結果與分析

2.1 組方提取物功效評價實驗結果

2.1.1 抑制透明質酸酶活性實驗結果

機體發生過敏性疾病或產生炎癥時，肥大細胞中作為化學傳遞物質的組胺起著重要作用。通過測定組胺的濃度，可評價樣品抗過敏效果。研究表明，透明質酸酶活性越高，組胺的釋放量就越高，透明質酸酶活性抑制和肥大細胞釋放組胺抑制活性之間具有很好的相關性。

圖1 提取物對透明質酸酶活性抑制作用Fig.1 Inhibition effect of extracts on hyaluronidase activity

組方提取物對透明質酸酶活性抑制結果見圖1，從圖中可以看出，隨著組方提取物濃度的增大，透明質酸酶抑制率也在逐漸增大，質量分數為6%的組方提取物對透明質酸酶抑制率達80.06%，當濃度達到8%時，抑制率達到88.92%，并呈一定的量效關系，實驗結果表明：組方提取物對透明質酸酶活性有較好的抑制作用。鑒于8%的添加量在實際配方用量太高，綜合考慮功效及性價比，故在以下實驗中將最高量初步定為6%。

2.1.2 清除自由基實驗結果

2.1.2.1 清除DPPH自由基實驗結果

圖2 提取物的DPPH自由基清除率Fig.2 DPPH radical scavenging rate of extracts

組方提取物對DPPH自由基清除率結果見圖2。從圖中可以看出，隨著組方提取物濃度的增大，DPPH自由基清除率也在逐漸增大。在組方提取物濃度為3%時，清除率為75.6%，當濃度為6%時，清除率達到90.1%。結果表明：組方提取物對DPPH自由基有較好的清除作用。

2.1.2.2 清除超氧陰離子自由基實驗結果

圖3 提取物的超氧陰離子自由基清除率 radical scavenging rate of extracts

組方提取物對超氧陰離子自由基清除率結果見圖3?？梢钥闯觯M方提取物具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力，在組方提取物濃度達到6%時，清除率達到72.1%，且對超氧陰離子自由基的清除作用隨濃度增加而增強。這表明組方提取物對超氧陰離子自由基同樣有較好的清除作用。

2.1.2.3 清除羥基自由基實驗結果

圖4 提取物的羥自由基清除率Fig.4 Hydroxyl radical scavenging rate of extracts

利用Fenton反應，檢測組方提取物對羥基自由基的清除作用，結果見圖4。從圖中可以看出，當組方提取物濃度為6%時，清除率達到74.8%，且對羥自由基的清除作用隨濃度增加而增強。結果表明：組方提取物對羥自由基也有較好的清除作用。

2.2 抑制KU812細胞中組胺釋放結果

在過敏和炎癥反應中，肥大細胞脫顆粒后釋放的活性介質可以直接參與過敏反應，由于嗜堿性細胞系KU812與肥大細胞具有高度相似性，適合用于建立人類肥大細胞激活和脫顆粒模型。KU812細胞活化導致細胞脫顆粒，化學介質釋放如組胺等促炎細胞因子。這些分子作用于血管、平滑肌等，擴大和維持炎癥反應，肥大細胞脫顆粒和一些細胞因子合成，完全依賴鈣流動，本實驗采用PMA和鈣離子載體聯合刺激KU812細胞，造成細胞內鈣升高，誘導肥大細胞脫顆粒。因此，本實驗建立PMA和A23187聯合誘導KU812細胞組胺釋放模型，用來評價提取物對組胺釋放的影響。組方提取物抑制KU812細胞中組胺釋放量實驗結果見表2。

表2 組方提取物對組胺釋放的影響Table 2 Effect of group extracts on histamine release

從表中可以看出，經PMA和A23187聯合誘導后，模型對照組組胺含量明顯升高，與空白對照組相比有極顯著性差異(P<0.01)。添加組方提取物后，組胺釋放量明顯降低，高、中劑量組較模型組有極顯著性差異(P<0.01)，低劑量組與模型組相比呈現顯著性差異(P<0.05)。這表明組方提取物能有效抑制組胺釋放量，具有一定的抗敏舒敏功效。

依據體外實驗結果，組方提取物在使用濃度為6%時，具有良好的清除透明質酸酶、清除自由基、抑制組胺釋放功效。為使舒敏乳能體現出較好的人體功效評價結果，綜合性價比，在制備舒敏乳中組方提取物添加量初步定為6%。

2.3 組方舒敏乳功效評價結果

2.3.1 經皮水分散失測試結果

測試期內，不同測試區域經皮水分散失量隨時間變化情況如圖5。經皮水分散失量越低，表明皮膚屏障功能越好，組方舒敏乳的舒敏修復效果越好?？傮w結果見圖6，樣品在第7天、第14天和第21天與本底值相比有極顯著差異(P<0.01)，這表明受試樣品具有顯著減少經皮水分散失、修復并增強皮膚屏障的功效。

圖5 不同區域經皮水分散失Fig.5 Trans-epidermal water loss in different areas

圖6 總區域經皮水分散失Fig.6 Trans-epidermal water loss in general areas注：與0天相比，**P<0.01(下同)。Note:Compared with dya 0,**P<0.01 (the same below).

2.3.2 皮膚含水量測試結果

測試期內，不同測試區域水分含量隨時間變化情況如圖7。測試期內額頭、臉頰、下顎的含水量都有所增加，這表明受試樣品的舒敏功能良好，且有一定的補水效果?？傮w實驗結果見圖8，樣品在第7天、第14天和第21天與本底值相比存在顯著差異(P<0.01)，這表明受試樣品具有顯著提高皮膚含水量、增強皮膚屏障的功效。

圖7 不同區域皮膚含水量Fig.7 Skin hydration in different areas

圖8 總區域皮膚含水量Fig.8 Skin hydration in general areas

2.3.3 皮膚舒緩測試結果

測試期內，不同測試區域皮膚血紅素值隨時間變化情況如圖9。測試期內額頭、臉頰、下顎的皮膚血紅素含量都呈下降趨勢，表明測試區域皮膚敏感的改善?？傮w結果見圖10，樣品在第7天、第14天和第21天相對于本底值存在顯著性差異(P<0.01)，這表明樣品具有顯著的舒緩肌膚功效。

圖9 不同區域皮膚血紅素Fig.9 Skin heme in different areas

圖10 總區域皮膚血紅素Fig.10 Skin heme in general areas

2.3.4 抗敏修復實驗結果

十二烷基硫酸鈉(SDS)是一種陰離子表面活性劑，是一種常用的皮膚刺激劑。用十二烷基硫酸鈉斑貼測試的皮膚敏感性評價，已成為研究刺激性接觸性皮炎經典模型[14]。本研究的目的是在封閉性的條件下，用10% SDS斑貼作用于皮膚5 h，去除10%SDS斑貼，以建立皮膚過敏模型；再將舒敏乳貼附于同位置皮膚上進行修復，隨著時間的推移，觀察皮膚的變化情況，對皮膚的反應進行評估。

由表3中的結果可以直觀看出：雖存在個體差異性，不同受試者的使用效果有所不同，但整體情況表明該乳液在舒敏方面效果良好。

3 結論

本文在前期研究基礎上對香薷、山慈菇、獨活、三棱、孩兒茶、遠志六味中藥提取制備得到組方提取物，利用抑制透明質酸酶活性實驗，清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基實驗，抑制組胺釋放實驗，探究組方提取物活性和作用機理。結果顯示，質量分數為6%的組方提取物對透明質酸酶抑制率達80.06%，對超氧陰離子、羥自由基、DPPH自由基清除率均在70%以上；濃度為200 μg/mL的組方提取物抑制組胺釋放率達52%，這表明組方提取物對透明質酸酶、三種自由基及組胺釋放均有一定的抑制或清除作用。

表3 受試者皮膚反應結果Table 3 Results of the skin response in the subjects

將組方提取物添加到乳液配方中，對舒敏乳液進行了相關人體功效評價，以驗證其對皮膚過敏癥狀的舒緩效果。結果表明，添加組方提取物乳液能顯著減少皮膚血紅素值(P<0.01)，減少皮膚水分散失(P<0.01)，提高皮膚水分含量(P<0.01)，有效改善皮膚過敏癥狀。

綜上所述，該組方提取物能有效抑制引發皮膚過敏反應物質的活性，緩解皮膚過敏癥狀，快速修復皮膚，增強皮膚屏障功能，是一款較為理想的化妝品用植物源原料。