科爾沁牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌cylE基因的克隆及抗原性分析

馮浩展，任憲峰，王 華，錫林高娃

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，內(nèi)蒙古乳源性致病菌工程防控中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043）

乳腺炎是奶牛最常見(jiàn)且較為多發(fā)的一種乳腺疾病，乳腺炎不僅影響乳汁品質(zhì)，而且降低產(chǎn)奶量。我國(guó)因臨床型奶牛乳腺炎淘汰的奶牛約占總淘汰牛的9%～11%，造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)了3.16億元[1]。B族鏈球菌（GBS）學(xué)名無(wú)乳鏈球菌（streptococcus agalactiea,S.agalactiea），GBS感染引發(fā)的乳腺炎是最常見(jiàn)的疾病之一。同時(shí)無(wú)乳鏈球菌也能引發(fā)奶牛乳腺炎并通過(guò)乳制品感染人類。其感染人群主要為飲用乳制品及接觸奶牛的免疫缺陷者[2]。據(jù)國(guó)外流行病學(xué)調(diào)查顯示，在引起敗血癥的致病菌中，無(wú)乳鏈球菌占敗血癥總致病菌數(shù)的85%以上[3]。同時(shí)，GBS也是造成孕婦產(chǎn)褥期膿毒血癥和新生兒腦膜炎的一個(gè)重要原因。該菌寄生在產(chǎn)婦生殖道內(nèi)，可導(dǎo)致嬰兒發(fā)生感染[4]，也可引起產(chǎn)后感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、皮膚和軟組織感染及骨髓炎。更為重要的是GBS通過(guò)牛奶和肉類等對(duì)孕婦和老人等免疫力低下或免疫功能不全的人群造成感染，引起敗血癥和心內(nèi)膜炎等疾病[5]。

溶血素又稱細(xì)胞溶素，根據(jù)在血瓊脂培養(yǎng)基上的溶血特征可分為α溶血素、β溶血素和γ溶血素3種類型?？茽柷吲Ｈ橄傺资怯搔氯苎蜔o(wú)乳鏈球菌造成的，它分泌的β-溶血素屬于穿孔毒素[6]，它能溶解紅細(xì)胞并使紅細(xì)胞釋放血紅蛋白。溶血素不同于其他通過(guò)哺乳動(dòng)物靶細(xì)胞內(nèi)化的毒素，而是作用于細(xì)胞膜，造成其結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，使大量細(xì)胞內(nèi)的成分泄漏，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。更可怕的是溶血素不僅溶解紅細(xì)胞，還損害其他多種類型的真核細(xì)胞，包括血小板、成纖維細(xì)胞、心肌細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等[7]。

近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)溶血素并非是cylE基因的表達(dá)產(chǎn)物。Rosa-Fraile等[8]的研究提出，GBS的溶血性和細(xì)胞溶解活性是由鳥(niǎo)氨酸鼠李糖多烯色素而不是由cylE蛋白引起的。布日額等[9]通過(guò)構(gòu)建cylE基因缺陷型菌株發(fā)現(xiàn)，缺失cylE基因的無(wú)乳鏈球菌將失去溶血性，因此cylE基因?qū)θ苎氐漠a(chǎn)生是必要的。如今，由于抗生素的濫用，導(dǎo)致耐藥菌的數(shù)量和種類持續(xù)增加，病原菌的防控依然是比較有效的手段，這就需要找到病原菌攜帶的有效免疫抗原。通過(guò)克隆科爾沁牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌cylE基因并分析其編碼蛋白性質(zhì)，為以后研究溶血素合成途徑及制備無(wú)乳鏈球菌新型疫苗做理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)乳鏈球菌為內(nèi)蒙古通遼地區(qū)患乳腺炎科爾沁牛的乳汁臨床分離株；大腸桿菌DH5α、pMD 18-T載體、Ecor I與 Hind III內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、DNAMarker、DNA凝膠回收試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

參照GenBank已公布牛源無(wú)乳鏈球菌的cylE基因序列(AF093787)，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，序列如下：

cylE1：CGAAAGCTTATGAAAGATGATAATA；

cylE2：TCGGAATTCTCATTTTTCTTCACACTT。

1.3 無(wú)乳鏈球菌DNA模板制備

將科爾沁牛乳腺炎臨床分離獲得的無(wú)乳鏈球菌進(jìn)行純化培養(yǎng)，然后參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取基因組DNA，經(jīng)電泳鑒定后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 目的基因的PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系 50.0 μL,10×PCR Buffer 5.0 μL,dNTP 4.0 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各 1.0 μL,DNA 模板 5.0 μL,Taq DNA 合酶 (5 U/μL)0.25 μL,ddH2O 33.75 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s,58℃ 30 s,72℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min,4℃保存。

1.5 克隆載體構(gòu)建與鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，利用DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收的片段與pMD 18-T載體在16℃下連接過(guò)夜后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用含有氨芐青霉素(Amp+)的LB培養(yǎng)基對(duì)菌落進(jìn)行篩選，并提取重組質(zhì)粒。提取的重組質(zhì)粒命名為pMD 18-T-cylE，同時(shí)進(jìn)行PCR及酶切鑒定。

1.6 目的基因序列分析

將轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pMD 18-T-cylE的感受態(tài)細(xì)胞DH5α送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序，利用DNASTAR軟件對(duì)其推導(dǎo)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及其抗原性進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

從患乳腺炎科爾沁牛乳汁中分離獲得的無(wú)乳鏈球菌基因組總DNA為模板，合成的P1/P2為引物進(jìn)行cylE基因PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，發(fā)現(xiàn)在1000 bp附近有一條特異條帶(見(jiàn)圖1)，與預(yù)期結(jié)果相符。

圖1 cylE基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳鑒定結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的PCR及酶切鑒定結(jié)果

重組質(zhì)粒pMD 18-T-cylE經(jīng)PCR鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出約1000 bp的片段;經(jīng)Hind III單酶切后得到約3700 bp的片段;經(jīng)Ecor I、Hind III雙酶切則得到約1000 bp和2700 bp的兩個(gè)片段(見(jiàn)圖2)。酶切獲得的片段及PCR擴(kuò)增片段均與預(yù)期結(jié)果相符，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pMD 18-T-cylE的酶切PCR及酶切鑒定結(jié)果

2.3 基因序列及其推導(dǎo)氨基酸序列分析結(jié)果

重組質(zhì)粒pMD 18-T-cylE經(jīng)測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)乳鏈球菌cylE基因片段共由999個(gè)堿基組成。將克隆獲得的cylE基因序列與Genbnak已公布的牛源無(wú)乳鏈球菌cylE基因序列進(jìn)行比對(duì),其兩者核苷酸序列相似性為99.9%，僅有1個(gè)核苷酸發(fā)生突變（1712C→A）。

2.4 氨基酸序列及其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果

通過(guò)DNASTAR軟件分析，經(jīng)克隆獲得的cylE基因序列共編碼333個(gè)氨基酸。與Genbnak已公布的牛源無(wú)乳鏈球菌cylE基因序列進(jìn)行比對(duì)，其兩者氨基酸序列相似度為99.7%，僅有1處氨基酸發(fā)生了突變571Ala→Asp。

使用PSIPRED在線分析網(wǎng)站，對(duì)cylE蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，無(wú)乳鏈球菌cylE蛋白共有63個(gè)α-螺旋，有133個(gè)β-折疊。其中α-螺旋占 18.92%（63/333），β-折疊占 39.93%（133/333）。其余為無(wú)規(guī)則卷曲。

2.5 cylE基因預(yù)測(cè)蛋白的親水性及其抗原性預(yù)測(cè)分析

圖3 cylE基因序列的相似性分析結(jié)果

圖4 cylE基因編碼氨基酸序列的相似性分析結(jié)果

圖5 cylE基因編碼蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)分析結(jié)果

使用DNASTAR軟件對(duì)cylE基因氨基酸序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，cylE預(yù)測(cè)蛋白的親水區(qū)域較廣，其主要分布在 6～19、30～40、67～151、184～198、208～229、244～285和307～331位氨基酸。而且親水區(qū)域在蛋白序列的N端較多。根據(jù)Jameson-Wolf方案預(yù)測(cè)其抗原指數(shù)。cylE預(yù)測(cè)蛋白含有較多抗原指數(shù)較高的區(qū)域，主要分布在 4～16、24～39、56～62、67～76、90～99、108～124、128～149、156～161、171～184、228～207、241～251、258～281和321～330位氨基酸，抗原性良好。綜上所述，cylE蛋白是親水蛋白，具有良好的抗原性。

圖6 cylE基因編碼蛋白質(zhì)疏水性及抗原性的預(yù)測(cè)分析結(jié)果

3 討論

至今為止，cylE的作用機(jī)制尚未明了，但它卻對(duì)溶血素的產(chǎn)生有著至關(guān)重要的作用，在無(wú)乳鏈球菌的較多致病因子中，溶血素起著破壞宿主細(xì)胞、使細(xì)胞內(nèi)成分大量泄漏和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的作用，是無(wú)乳鏈球菌致病的主要因子。

根據(jù)試驗(yàn)測(cè)序獲得cylE基因序列為999 bp，使用獲得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，相似性為99.9%，其中原1712位的C突變?yōu)锳，導(dǎo)致其氨基酸序列第571位丙氨酸突變?yōu)樘於彼帷?/p>

Whidbey等[10]的研究表明，溶血素的實(shí)質(zhì)是名為鳥(niǎo)氨酸鼠李糖脂的色素，值得注意的是，cylE基因的存在是溶血素產(chǎn)生的必要條件。目前雖然針對(duì)表面蛋白的疫苗在小鼠感染模型中被證明能提供抗GBS的保護(hù)[11]，但基于蛋白質(zhì)的疫苗不能中和這種脂質(zhì)毒素的作用，我們可以針對(duì)cylE基因表達(dá)產(chǎn)物制作疫苗來(lái)抑制溶血素的產(chǎn)生。而本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)cylE蛋白序列進(jìn)行親水性和抗原性分析發(fā)現(xiàn)，cylE蛋白具有較高的親水性，同時(shí)也具有良好的抗原性。符合候選靶標(biāo)抗原的要求，說(shuō)明cylE蛋白是防治無(wú)乳鏈球菌病的理想抗原候選分子。

科爾沁牛乳腺炎無(wú)乳鏈球菌cylE基因編碼的蛋白具有良好的抗原性，可作為防治無(wú)乳鏈球菌的抗原候選分子之一，為后續(xù)研究預(yù)防牛乳腺炎疫苗提供理論參考依據(jù)。