支氣管肺泡灌洗液和痰液Xpert MTB/RIF檢測對肺結核臨床診斷的價值分析*

茍海梅，薛鰻玲，鐘曉武,3，喻曉倩，方 莉△

1.川北醫學院附屬醫院檢驗科,四川南充 637000；2.川北醫學院檢驗系,四川南充 637000；3.川北醫學院轉化醫學研究中心,四川南充 637000

結核病(TB)是由結核分枝桿菌(MTB)引起的一種傳染性疾病，可感染人體多個部位，以肺結核為主。目前TB仍然是全球的1項重大健康問題，2019年，全球MTB感染人數約1 000萬，死亡人數約141萬。中國是TB高負擔國家之一，2019年約有83.3萬新發TB患者，位居全球第3位[1]。有效控制TB的關鍵之一就是早期診斷，目前TB確診主要依賴于細菌學檢查，但傳統方法抗酸桿菌涂片檢出率較低、靈敏度不高、容易漏診，無法完全滿足臨床需求。結核分枝桿菌及利福平耐藥快速檢測(Xpert MTB/RIF)是一種新的分子診斷方法，采用半巢式實時熒光聚合酶鏈反應(PCR)，通過ropB基因RRDR核心區的5個重疊分子探針來實現MTB及利福平耐藥位點檢測，具有快速、高靈敏度、高特異度等特點[2]。本研究對可疑肺結核患者的支氣管肺泡灌洗液和痰液進行Xpert MTB/RIF，旨在探討Xpert MTB/RIF在肺結核中的臨床診斷價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性分析2019年1月至2021年5月川北醫學院附屬醫院送檢Xpert MTB/RIF的1 352例可疑肺結核患者，其中男877例，女475例，平均年齡(52.12±18.17)歲。Xpert MTB/RIF只送檢肺泡灌洗液的患者830例，只送檢痰液的患者482例，同時送檢肺泡灌洗液和痰液的患者40例；共有619例患者進行了抗酸涂片和γ-干擾素釋放試驗(IGRAs)。依據中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會發布的肺結核診斷標準：WS 288-2017[3]，對1 352例疑似肺結核患者進行臨床確診診斷，最終確診肺結核699例(肺結核組)，非肺結核653例(非肺結核組)。

1.2方法 Xpert MTB/RIF 儀器和配套試劑盒來自賽沛(上海)商貿有限公司，肺泡灌洗液和痰液Xpert MTB/RIF檢測按照儀器說明書規范操作及結果判定。抗酸涂片按照《中國結核病防治規劃痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證手冊》[4]的操作程序進行，檢測標本為肺泡灌洗液或痰液。IGRAs檢測試劑盒來自德國凱杰，檢測標本為肝素抗凝血，IGRAs操作及結果判定按照說明書進行。

1.3統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件進行數據分析處理。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、約登指數、Kappa系數和受試者工作特征曲線(ROC曲線)下面積(AUC)綜合評估不同檢測方法的診斷效能。Kappa系數≤0.4一致性差；0.40.9診斷價值較高[5]。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1兩組肺泡灌洗液和痰液Xpert MTB/RIF系統中MTB檢出情況 在肺結核組肺泡灌洗液標本中有233例Xpert MTB/RIF檢出MTB陽性，肺泡灌洗液檢出率為70.2%；在肺結核組痰液標本中有280例Xpert MTB/RIF檢出MTB陽性，痰液檢出率為71.2%。在非肺結核組中有1例肺泡灌洗液和1例痰液標本Xpert MTB/RIF檢出MTB陽性。見表1。在26例同時送檢肺泡灌洗液和痰液標本的肺結核患者中，肺泡灌洗液標本的檢出率為61.5%，高于痰液標本的檢出率(42.3%)，共有8例患者同時肺泡灌洗液和痰液檢出MTB，見表2。

表1 兩組肺泡灌洗液和痰液Xpert MTB/RIF系統中MTB檢出情況比較[%(n/n)]

表2 同時送檢肺泡灌洗液和痰液患者Xpert MTB/RIF系統中MTB檢出情況比較[%(n/n)]

2.23種檢測方法診斷肺結核的效能比較 在同時采用Xpert MTB/RIF、抗酸涂片及IGRAs檢測的619例可疑肺結核患者中，以臨床最終診斷為金標準，分析比較3種檢測方法對肺結核的診斷效能。IGRAs的靈敏度均高于Xpert MTB/RIF和抗酸涂片，差異均有統計學意義(P<0.05)；Xpert MTB/RIF和抗酸涂片的特異度均明顯高于IGRAs，差異均有統計學意義(P<0.05)；Xpert MTB/RIF的陽性預測值最高，且三者差異均有統計學意義(P<0.05)；IGRAs的陰性預測值均高于Xpert MTB/RIF和抗酸涂片，差異均有統計學意義(P<0.05)。Xpert MTB/RIF的約登指數、Kappa系數和AUC均大于抗酸涂片和IGRAs，差異均有統計學意義(P<0.05)；3種方法聯合檢測的AUC為0.896，均大于3種方法單獨檢測。見表3和圖1。

表3 3種方法診斷肺結核的效能比較

圖1 3種方法診斷肺結核的ROC曲線

2.3Xpert MTB/RIF對利福平耐藥位點檢測 在采用Xpert MTB/RIF進行檢測的肺泡灌洗液和痰液MTB陽性的肺結核患者中，有59例檢出利福平耐藥，利福平耐藥率為11.7%(59/505)。利福平耐藥基因突變檢測結果顯示，Probe E(529-533)探針突變比例最高，占52.5%(31/59)，其次為Probe D(523-529)，占16.9%(10/59)，Probe B(512-518)占 11.9%(7/59)，Probe A(507-511)占6.8%(4/59)，Probe A合并Probe B 占5.1%(3/59)，Probe A合并Probe D 占3.4%(2/59)，Probe A合并Probe E占3.4%(2/59)，本研究尚未檢測出Probe C(518-523)探針突變。

3 討 論

Xpert MTB/RIF技術是近幾年出現的一種新的分子生物學檢測方法，在2010年被WHO推薦應用于臨床。2013年，WHO在更改意見中將Xpert MTB/RIF作為MTB感染人群的首選篩查方法，用于替代傳統抗酸涂片和培養法[6]。2017年，新版肺結核診斷標準已經將MTB核酸檢測作為確診條件之一[3]。Xpert MTB/RIF技術簡便、耗時短、交叉污染少，并且能同時檢測MTB及其是否對利福平耐藥，在肺結核快速診斷中具有里程碑意義。

結核組采用Xpert MTB/RIF肺泡灌洗液和痰液標本MTB檢出率分別為70.2%和71.2%，二者差異無統計學意義(P>0.05)。但在同時送檢肺泡灌洗液和痰液標本的肺結核患者中，肺泡灌洗液檢出率(61.5%)高于痰液檢出率(42.3%)。大多數肺結核患者只送檢了一種類型的標本，僅有26例同時送檢了肺泡灌洗液和痰液標本，故肺結核患者肺泡灌洗液和痰液標本檢出率可能存在患者結構的異質性。戴景濤等[7]研究結果顯示，肺泡灌洗液檢出率高于痰液，本研究推測，采用Xpert MTB/RIF肺泡灌洗液的靈敏度可能高于痰液標本。但本研究中同時送檢肺泡灌洗液和痰液標本的肺結核病例數較少，結果存在一定的局限性，還需進一步擴大樣本量加以驗證。此外，高波[8]、范錫同等[9]和陳小娟等[10]的研究結果顯示，MTB在結核患者痰液Xpert MTB/RIF中檢出率為分別為94.44%、69.92%和51.85%,提示采用Xpert MTB/RIF MTB的檢出率在不同研究中存在差異。這可能與以下因素相關：(1)金標準存在差異，以培養結果為金標準的檢出率可能高于以臨床最終診斷結果為金標準的檢出率；(2)結核患者結構存在異質性，如兒童TB細菌載量低，細菌學檢測的靈敏度低于成人[11-12]；(3)研究樣本量存在差異，樣本量小可能造成結果偏倚；(4)Xpert MTB/RTF系統在不同人群、不同環境及不同測試策略中，靈敏度可能會存在差異。在非肺結核組中，采用Xpert MTB/RTF肺泡灌洗液和痰液標本均出現MTB假陽性結果，可能是因為交叉污染所致。雖然Xpert MTB/RTF的PCR過程(提純、擴增和檢測)整合在一個封閉的反應體系內，減少了人為誤差和交叉污染的可能性，但仍需要手工對標本進行前處理和加樣，仍存在交叉污染的風險。

為了進一步探討Xpert MTB/RIF在肺結核臨床診斷中的應用價值，本研究分析比較Xpert MTB/RIF與抗酸涂片和IGRAs檢測的診斷效能。Xpert MTB/RIF靈敏度為64.7%，高于抗酸涂片(36.1%)，低于IGRAs(86.8%)；Xpert MTB/RIF特異度為99.6%，高于抗酸涂片(99.1%)和IGRAs(55.6%)。Xpert MTB/RIF陽性需要MTB數量達到131 cfu/mL[13]，而抗酸染色鏡檢陽性需要痰液中MTB數量達到10 000條/mL[14]，因此,Xpert MTB/RIF的靈敏度高于抗酸涂片。抗酸涂片不能區分結核與非結核分枝桿菌，非結核分枝桿菌與抗酸涂片假陽性相關，因此，非結核分枝桿菌可影響抗酸涂片的特異度和陽性預測值。IGRAs靈敏度雖高于Xpert MTB/RIF，但IGRAs無法區分潛伏感染結核和活動性結核，其特異度較低，陽性預測值較低，容易出現假陽性，因此，IGRAs陽性結果不能作為活動性結核的確診標準，IGRAs更適合結核篩查及結核的排除診斷[15]。綜合靈敏度和特異度，Xpert MTB/RIF較抗酸涂片和IGRAs在肺結核診斷中更具有臨床價值。Xpert MTB/RIF的約登指數均大于抗酸涂片和IGRAs，表明Xpert MTB/RIF發現結核患者與非結核患者的總能力強于抗酸涂片和IGRAs。Kappa系數可用于評價診斷方法與金標準的一致性,本研究中Xpert MTB/RIF的Kappa系數為0.577，大于抗酸涂片和IGRAs，表明Xpert MTB/RIF與臨床最終診斷結果一致性較好，且優于抗酸涂片和IGRAs。本研究Xpert MTB/RIF的AUC為0.821，接近診斷價值較高的臨界值0.900，表明Xpert MTB/RIF在肺結核診斷中具有相對較好的診斷價值。Xpert MTB/RIF的AUC雖大于抗酸涂片和IGRAs，Xpert MTB/RIF的診斷價值高于抗酸涂片和IGRAs，但三者聯合檢測的AUC最大，診斷價值最高。

Xpert MTB/RIF利福平耐藥結果顯示，利福平耐藥率為11.7%，其中Probe E探針突變比例最高，未檢測出Probe C探針突變，與國內外相關研究報道結果相似[16-19]。利福平耐藥基因存在探針聯合突變，聯合探針突變更易發生于復治患者[18-19]，本研究聯合突變類型包括Probe A和Probe B探針、Probe A和Probe D探針及Probe A和Probe E探針，探針聯合突變類型與UDDIN等[19]的研究報道一致。

綜上所述，Xpert MTB/RIF能同時檢測MTB及其是否對利福平耐藥，采用Xpert MTB/RIF肺泡灌洗液和痰液標本在肺結核診斷中具有較高的靈敏度和特異度，診斷效能較好，在肺結核的臨床診斷中具有較高的應用價值。