隱球菌耐藥機制研究進展

祁 傲，胡慧敏 綜述,陳世平 審校

1.中國藥科大學綜合門診部，江蘇南京 210000； 2.南京醫科大學第二附屬醫院微生物室，江蘇南京 210000 ；3.南京醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，江蘇南京 210000

隱球菌是擔子菌酵母類真菌，廣泛分布于自然界，在鴿糞中大量存在，也可存在于人體表面、口腔和腸道中。隱球菌屬包括17個種和8個變種，其中對人致病最主要的是新型隱球菌及其變種[1]。隱球菌病是由新型隱球菌引起的深部真菌病，主要侵犯中樞神經系統和肺，常發生于惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤或應用大劑量糖皮質激素或化療等免疫功能低下的患者[2]。2015年，FANG等[3]報道了我國免疫功能正常人群發生隱球菌感染的病例。隱球菌的毒力因子包括莢膜、黑色素、脲酶、磷脂酶、降解酶等。常見抗新型隱球菌感染的藥物包括多烯類、唑類、核酸抑制劑類。近年來，隱球菌耐藥問題日漸突出，成為其感染治療失敗的一個重要原因。氟康唑治療過程中出現耐藥可能與藥物劑量不達標或治療缺乏依從性有關[4]。臨床上耐藥菌株的產生通常是多種因素共同作用的結果[5]。本文對隱球菌耐藥機制綜述如下。

1 隱球菌的耐藥機制

1.1生物膜的形成 生物膜是菌體適應外部環境、抵抗外界傷害所做出的反應，它是一種由融合的芽生孢子層、菌絲成分和細胞外多聚基質組成的二維結構[6]。形成生物膜的能力是新型隱球菌抗性的表現，膜內菌對藥物、高溫、寒冷、紫外線等更具抵抗性，生物膜形成可導致患者出現臨床耐藥并反復感染[6]。通常，新型隱球菌可在各種組織上形成生物膜并將自身包裹，阻止或延緩抗真菌藥物進入細胞內，這些組織可以是活組織，也可以是無活力組織。細胞外多聚基質形成的生物屏障是菌株出現多重耐藥的主要原因。有研究證實，有生物膜的菌株比浮游菌株對各種抗真菌藥物有不同程度的抗藥性，尤其是對唑類具有完全抗藥性[7-8]。生物膜除了作為生物屏障防止藥物進入菌體外，還可以通過限制營養的方式減緩菌體生長，從而避免因菌體活性過高被藥物殺傷[9]。ROBERTSON等[10]研究表明，細胞外基質分泌的乙二胺四乙酸能阻止生物膜形成，這種阻止可以在加入二價陽離子(如鎂、鈣)后逆轉，提示缺乏二價陽離子可抑制生物膜形成。這一發現可能成為隱球菌耐藥病例治療新的突破口。

1.2麥角固醇合成酶基因(ERG11)改變 麥角固醇由真菌合成，是真菌細胞膜的主要組分，也是唑類抗真菌藥物的作用靶點。14-α-去甲氧基酶是合成麥角固醇的關鍵酶，該酶由ERG11編碼。唑類藥物通過黏附作用限制14-α-去甲氧基酶的活性，影響細胞膜形成而發揮抗真菌作用。ERG11改變包括基因高表達和基因突變，高表達意味著合成更多的14-α-去甲氧基酶，且需要更高的藥物濃度來抑制該酶；基因突變導致藥物對該酶的親和力降低[11-12]，從而使耐藥性增加。有學者通過分析某些耐藥菌株ERG11的基因序列，發現一位點上甘氨酸484被絲氨酸替代，此為氟康唑耐藥的突變位點，與氟康唑最低抑菌濃度提高密切相關[13]。

1.3藥物外排增加 藥物外排增加使細胞內藥物濃度減少，從而產生對抗真菌藥物的耐藥性。藥物外排增加可由菌株內多藥物轉運蛋白上調來實現。多藥物轉運蛋白包括ABC超家族轉運蛋白和MFS超家族轉運蛋白，前者在新型隱球菌中發揮主要作用。ABC轉運蛋白有三大家族參與藥物外排，分別是多藥耐藥家族、多藥耐藥相關蛋白家族、多效性耐藥家族[14]。新型隱球菌中ABC轉運蛋白由抗真菌藥物耐藥基因1(AFR1)編碼，在耐唑類藥物菌株中呈高表達[14]，提示AFR1上調與新型隱球菌的唑類抗性密切相關。有研究發現，ABC轉運蛋白對兩性霉素B、5-氟胞嘧啶、棘白菌素的靈敏度無明顯作用[15]。

1.4基因組的可塑性 染色體重排、異染色體形成、非整倍體或二倍體形成均是基因組可塑性的體現，可以影響藥物作用靶點或外排泵的表達，從而產生耐藥。新型隱球菌分為A、B、C、D和AD 5個血清型[16]，SIONOV等[17]在血清型A和D的菌株中發現了染色體二倍體，這是新型隱球菌為了適應氟康唑而形成的。染色體二倍體數量越多，菌株耐受氟康唑的濃度越高，一旦停止用藥后，二倍體數量減少，可使原本耐藥菌株重新回到敏感水平。抗真菌藥物可通過隱球菌凋亡誘導因子(AIF)誘發新型隱球菌類似細胞凋亡的細胞死亡，新型隱球菌可通過下調AIF表達而減少細胞凋亡。有研究發現，剔除AIF可促進染色體多倍體形成，從而對氟康唑產生耐藥[18-19]。新型隱球菌耐藥主要體現在1號染色體上，1號染色體的重塑與ERG11和AFR1 2個基因關系甚密，這種適應機制最終導致氟康唑治療隱球菌病失敗或者在維持治療過程中復發。

1.5異質性耐藥 異質性耐藥的特點是在敏感菌株的單個菌落內出現高耐藥水平的較小亞群，是真菌耐藥的一種特殊類型。MONDON等[20]報道了新型隱球菌對氟康唑的異質性耐藥現象，新型隱球菌對唑類的異質性耐藥廣泛存在，這種耐藥是固有的，且與菌株的毒力有關，但耐藥水平與其毒力水平不一定呈正相關[7]。新型隱球菌異質性耐藥的出現通常與患者長期應用某種藥物有關。藥物長期作用導致新型隱球菌的染色體發生變異，從而引起其表型變化，體現在隱球菌生長模式、形態和毒力等方面，這可能是隱球菌病在治療過程中即使抗真菌藥物沒有停用，疾病也會加重或復發的原因。當藥物壓力作用消失，這種耐藥性也會隨之消失，菌株可以恢復到原來的敏感水平[21]。有研究表明，異質性耐藥主要出現在唑類單藥治療過程中，聯合治療可有效避免異質性耐藥產生，如氟康唑聯合5-氟胞嘧啶治療可有效抑制體內耐藥亞群擴增[22-23]，研究其異質性耐藥水平有助于在長期維持治療過程中合理使用氟康唑。

1.6真菌耐藥性的表觀遺傳機制 表觀遺傳不是通過改變DNA序列或蛋白質編碼，而是由DNA序列修飾以外的因素介導目標基因的表達[24]，這一作用是瞬間影響，主要有基于RNA和基于染色質修飾兩種機制，與隱球菌密切相關的為基于染色質修飾。染色質修飾主要有兩種：結構修飾和化學修飾。結構修飾指DNA-DNA相互作用和染色質重塑，化學修飾指烷基化、磷酸化、泛素化等。目前已知新型隱球菌中HDAC基因參與了染色質的去乙酰化過程，它被證實是可以調節菌株毒力和適應外界壓力所需的基因[24]，一旦該基因缺失，將導致菌株毒力下降及對外界壓力敏感[25]。

1.7應激反應通路的調節 微生物具有對抗外界各種壓力刺激的能力，其中抗菌藥物就是重要的外界壓力刺激，這種能力通過復雜的應激反應通路實現。分子伴侶蛋白熱休克蛋白90(HSP90)能維持各種酶的穩定性，是真菌對抗真菌藥物應激反應通路中必不可少的關鍵蛋白，它通過鈣調神經磷酸酶控制應激反應，包括耐藥性。有研究顯示，HSP90可以增加新型隱球菌對唑類和棘白菌素的抗性，抑制其表達能有效降低新型隱球菌的耐藥性[26]。

1.8其他耐藥基因的表達

1.8.1同源基因(PKH) 新型隱球菌PKH在其生物活動及隱球菌病發病機制信號傳導中發揮重要作用。PKH又稱磷酸肌醇激酶1，有PKH1、PKH2、PKH3 3種，PKH1和PKH2主要參與調節細胞生命功能，包括細胞RNA的新陳代謝、維持細胞壁的完整性及鞘脂生物合成等；PKH3主要參與新型隱球菌的抗性形成，包括其毒力、氧化應激及抗真菌藥物[27]，尤其是對氟康唑和兩性霉素B的耐藥。此外，PKH2還與新型隱球菌抑制腫瘤壞死因子及產生氧自由基有關。總之，PKH參與調節了新型隱球菌的抗性。

1.8.2Kar2 Kar2是未折疊蛋白反應(UPR)通路下游重要的分子伴侶，參與UPR信號通路調控內質網蛋白質的各種活動。JUNG等[28]研究發現，缺乏Kar2的新型隱球菌因不能耐受應激、高熱、抗真菌藥物等外界壓力而易出現死亡；相反，Kar2超表達則可有效解決錯誤蛋白質折疊，使毒性蛋白降解，維持細胞生存。由此可見，Kar2基因與新型隱球菌的適應性和抗性形成密不可分，在其生長過程中不可或缺。

2 小 結

隱球菌的耐藥機制十分復雜，可以是一種也可以是多種機制并存。井然等[29]研究顯示，我國目前新型隱球菌對伏立康唑全部敏感，但從2013開始就分離出了對氟康唑耐藥的新型隱球菌菌株，且至今其耐藥率逐年緩慢增加，由此提示全面認識隱球菌的耐藥機制已刻不容緩。隨著科學技術的發展及研究的進一步深入，將會有新的耐藥機制被發現，了解這些耐藥機制可以幫助臨床醫生從分子生物學角度更好地識別隱球菌，從而選擇有效的抗真菌藥物造福廣大患者。