跨膜絲氨酸蛋白酶4在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中影響細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機制*

李明亮，趙建英，田 笑，欒 亮，劉 靜，蔡 婧

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，遼寧沈陽 110016

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見的腫瘤之一，同時也是女性腫瘤相關(guān)死亡的第二大原因[1]。盡管目前在乳腺癌早期診斷和治療中取得了明顯成效,但乳腺癌的高發(fā)病率和高病死率仍引起全球廣泛關(guān)注，并且乳腺癌的各種不良預(yù)后絕大部分源于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[2-3]。因此，研究乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移機制并尋找新的治療靶點十分重要。 跨膜絲氨酸蛋白酶4(TMPRSS4)是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族中的一員，TMPRSS4水平可在多種腫瘤中呈高表達(dá)，包括胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等，由于其具有胰酶活性，可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程中起重要作用[4]。近年來有研究表明，TMPRSS4參與多種腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，包括前列腺癌、肺癌[5]和肝癌[6]等。近期有研究表明，TMPRSS4水平在乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中呈高表達(dá)且通過上皮細(xì)胞間充質(zhì)化(EMT)進(jìn)程調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[7]。MCF-7細(xì)胞是常見的雌激素受體陽性的人乳腺癌細(xì)胞，TMPRSS4在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的生物學(xué)作用及分子機制尚不清楚。本研究不僅檢測了TMPRSS4在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況，還通過干擾其表達(dá)水平探討其在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中的生物學(xué)功能，為尋找乳腺癌治療的新靶點提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1材料 人正常乳腺細(xì)胞HBL-100，MCF-7、ZR-75-1、ZR-75-30 3種乳腺癌細(xì)胞，所有細(xì)胞株均來源于中國醫(yī)科大學(xué)遺傳學(xué)教研室。

1.2儀器與試劑

1.2.1儀器 中國杭州博日科技有限公司聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀，美國羅氏公司實時熒光定量PCR(qPCR)擴增儀Light Cycler，美國阿爾法公司電泳凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Bio-Rad凝膠電泳儀，日本奧林巴斯倒置相差顯微鏡。

1.2.2試劑 MEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)，qPCR試劑盒(日本Takara公司)，BCA蛋白含量檢測試劑盒(中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，兔抗人TMPRSS4多克隆抗體(美國Abcam公司)，Transwell小室(美國Corning公司)，實驗所用慢病毒購于上海吉滿生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 人正常乳腺細(xì)胞HBL-100、乳腺癌細(xì)胞MCF-7在細(xì)胞常規(guī)條件下培養(yǎng)，正常換液和傳代，待細(xì)胞長滿瓶底后，選取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2qPCR 采用Trizol法提取總RNA，采用紫外分光光度計檢測標(biāo)本RNA濃度和純度，以A260/A280在1.8～2.0提示標(biāo)本滿足要求。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行PCR擴增分析，引物委托上海吉滿生物科技有限公司合成，擴增體系50 μL：Taq酶1 μL、Taq buffer 5 μL、MgCl23 μL、 dNTP 1 μL、上下游引物各1 μL、cDNA模板1 μL、ddH2O 37 μL。擴增條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共40個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。擴增后產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用Bio-Rad分析系統(tǒng)掃描分析，TMPRSS4基因表達(dá)水平= TMPRSS4基因A值/β-actinA值。

1.3.3Western blot 按照BCA試劑盒說明書提取總蛋白，然后進(jìn)行Western blot。電泳條件：濃縮膠80 V，分離膠100 V，時間1.5 h；轉(zhuǎn)膜條件：200 mA,時間2 h。顯色成像后用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。

1.3.4慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞 慢病毒載體是以人類免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)改造得到的基因治療載體，慢病毒轉(zhuǎn)染后可以使目的基因整合到細(xì)胞染色體中，并且穩(wěn)定、持久地表達(dá)。本實驗用包含有TMPRSS4干涉片段基因的慢病毒包裝質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，從而獲得病毒包裝后的重組慢病毒載體，由上海吉滿生物科技有限公司構(gòu)建。實驗共設(shè)3組，分別為含TMPRSS4干涉片段的慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞(LV-TMPRSS4-RNAi組),不含TMPRSS4干涉片段的慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞(NC組)，未用慢病毒轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞(Control組)。先根據(jù)病毒與細(xì)胞數(shù)量比值(MOI)不同分組，通過預(yù)實驗確定慢病毒感染細(xì)胞的MOI和最佳感染條件。制備含50 μg/mL Polybrene的培養(yǎng)基P(M)，含50 μg/mL Polybrene的ENI.S感染增強溶液P(E)各200 μL。按表1加入相應(yīng)溶液形成A、B、C、D 4種條件，混勻培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染72 h后，采用熒光顯微鏡觀察感染效率，感染效率80%以上作為轉(zhuǎn)染最佳條件，正式轉(zhuǎn)染時使用。

1.3.5轉(zhuǎn)移和侵襲實驗 根據(jù)文獻(xiàn)[6]介紹的方法進(jìn)行劃痕實驗及制備細(xì)胞侵襲模型。將細(xì)胞懸液接種于六孔板中，待細(xì)胞融合接近100%時，用中槍頭劃痕，用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞后，在無胎牛血清培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0、24 h后拍照，觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力。用基質(zhì)膠包被Transwell上室，制備侵襲模型。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，用結(jié)晶紫染液染色后于顯微鏡下觀察細(xì)胞侵襲能力的變化情況。

2 結(jié) 果

2.1TMPRSS4在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平 TMPRSS4在正常乳腺細(xì)胞及3種乳腺癌細(xì)胞中mRNA和蛋白表達(dá)水平見圖1(GAPDH為蛋白內(nèi)參)，與正常乳腺細(xì)胞比較，TMPRSS4在3種乳腺癌細(xì)胞中均呈高表達(dá)。

2.2慢病毒轉(zhuǎn)染效率和干涉效果 慢病毒轉(zhuǎn)染后TMPRSS4在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中表達(dá)水平比較見表2。慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞72 h后，采用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，見圖2A。Western blot檢測轉(zhuǎn)染后TMPRSS4蛋白表達(dá)水平見圖2B。

表2 慢病毒轉(zhuǎn)染后TMPRSS4在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中表達(dá)水平比較

注：A為mRNA表達(dá)水平；B為蛋白表達(dá)水平。

注：A為慢病毒轉(zhuǎn)染；B為TMPRSS4蛋白表達(dá)水平。

2.3TMPRSS4沉默表達(dá)的MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲能力的變化 TMPRSS4沉默表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株轉(zhuǎn)移和侵襲能力均減弱，見圖3。

注：A為轉(zhuǎn)移實驗；B為侵襲實驗。

3 討 論

乳腺癌是女性常見的腫瘤。在美國，女性腫瘤患者中大約有33%是乳腺癌，在全球范圍內(nèi)，乳腺癌在腫瘤致死原因中居第2位[8-9]。而在乳腺癌患者中，只有10%的死亡是由原發(fā)腫瘤引起，其余90%均是通過局部入侵淋巴、血管擴散轉(zhuǎn)移到肝、肺、骨和大腦等器官導(dǎo)致患者死亡。有研究顯示，乳腺癌可在早期就發(fā)生轉(zhuǎn)移，其發(fā)生轉(zhuǎn)移的機制是多種因素共同作用的結(jié)果[10]。有研究表明，酪氨酸蛋白激酶可通過TAZ和STAT5信號調(diào)控骨-腫瘤相互作用來促進(jìn)乳腺癌的溶骨性轉(zhuǎn)移[11]；半胱氨酸蛋白酶抑制劑(CST1)高表達(dá)可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖、增強其轉(zhuǎn)移和侵襲能力，相反CST1沉默則會減弱這種惡性特征[12]；CHI等[13]研究發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞免疫球蛋白及黏蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白高表達(dá)后也可以通過激活原癌基因MYC來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。有些因素會抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移，有研究表明，miR-124-3p可以通過抑制原癌基因CBL的表達(dá)負(fù)向調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[14]；miR-199a-5p在三陰性乳腺癌中可以通過抑制EMT進(jìn)程來抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[15]。

TMPRSS4是Ⅱ型跨膜絲氨酸蛋白酶家族中的一員，TMPRSS4可在多種腫瘤中過表達(dá)，且參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。有研究證明，TMPRSS4在大腸癌中過表達(dá)，并且可促進(jìn)FAK、ERK1/2、 Akt、Src和Rac1活化，上調(diào)整合素-α5 調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲[16]。在前列腺癌和肺癌細(xì)胞中，TMPRSS4可誘導(dǎo)uPA基因表達(dá)，通過依賴JNK的方式激活轉(zhuǎn)錄因子AP-1、Sp1/3的活性調(diào)控癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，有研究顯示，在肝癌細(xì)胞中，TMPRSS4過表達(dá)可明顯促進(jìn)肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移來誘導(dǎo)腫瘤血管的生長。有研究表明，在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中TMPRSS4可通過促進(jìn)波形蛋白和Slug，抑制E-cadherin和claudin-1的表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，TMPRSS4在MCF-7細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且在腫瘤的轉(zhuǎn)移中起促進(jìn)作用。本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞干擾TMPRSS4的表達(dá)來研究其生物學(xué)功能，目前慢病毒轉(zhuǎn)染被廣泛應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中，慢病毒載體可以將外源性基因有效整合到目標(biāo)細(xì)胞染色體上，起干擾目標(biāo)基因表達(dá)的作用，并且能夠長期抑制目標(biāo)基因在細(xì)胞中的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著TMPRSS4表達(dá)水平的改變，MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力也發(fā)生變化。慢病毒轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞后使TMPRSS4表達(dá)沉默，其轉(zhuǎn)移和侵襲能力明顯減弱。由此可以得出TMPRSS4可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的結(jié)論。

本研究推測，TMPRSS4通過調(diào)控表皮生長因子受體(EGFR)基因表達(dá)來發(fā)揮作用。EGFR是一種酪氨酸激酶受體蛋白，屬于ErbB家族。EGFR功能多樣，有研究顯示,EGFR表達(dá)失控與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，頭頸部腫瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肺癌和膀胱腫瘤等均存在EGFR過表達(dá)[18]。EGFR還參與EMT進(jìn)程的發(fā)生和癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移,與癌細(xì)胞的增殖、運動、生存和轉(zhuǎn)移有關(guān)。近期有研究表明，miRNAs和其他蛋白可通過調(diào)控EGFR水平發(fā)揮生物學(xué)功能，在結(jié)直腸癌中，miR-520a-3p 可通過調(diào)控EGFR表達(dá)水平發(fā)揮腫瘤的抑制作用[19]。在乳腺癌細(xì)胞中POPDC1可負(fù)調(diào)控EGFR誘導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖。在導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中，claudin-18通過EGFR/RAS/ERK通路過表達(dá)，對癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲發(fā)揮促進(jìn)作用[20]。由此，本研究推測，在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中TMPRSS4也可能通過調(diào)控EGFR表達(dá)水平來調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲等生物學(xué)進(jìn)程，這是下一步研究的重點。

綜上所述，TMPRSS4在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中呈高表達(dá)，并且可增強細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力，加速腫瘤的進(jìn)展。