不同磷肥對附子農藝性狀、產量以及品質的影響研究

閆鵬東，付 盟，韋潔敏，張國彥，崔浪軍

(1.西北瀕危藥材資源開發國家工程實驗室/藥用資源與天然藥物化學教育部重點實驗室/陜西師范大學 生命科學學院，陜西 西安 710119；2.延安大學 生命科學學院，陜西延安 716000；3.城固縣群利中藥材合作社，陜西 漢中 723200)

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)的子根，是我國著名的傳統大宗中藥材之一。附子始載于《神農本草經》，被譽為“回陽救逆第一品藥”。附子因其具有抗炎、鎮痛、強心、抗心律失常、降血糖、抗癌、免疫抑制等藥理作用[1]，被廣泛用于醫藥、食療行業。隨著近年來我國中醫藥行業的升溫，以及附子的相關藥理學研究的深入，市場對附子的需求量逐步增加，全國附子的種植面積也隨之增加。磷是植物生長和繁殖過程中所必需的基本營養元素之一，對植物的生長發育、產量形成、品質改善具有重要意義[2, 3]。磷肥包括磷酸二氫鉀、過磷酸鈣、鈣鎂磷肥等多種，不同的磷肥對不同的作物產量和品質影響不同[4, 5]。磷肥施入土壤，經溶解和水解作用，以不同形式的磷酸離子存在，易被土壤吸附、固持，加之一些土壤微生物將磷肥轉化為作物不易吸收的有機形式，使磷肥在土壤中表現為低利用性，因此在生產實踐中常投入過量磷肥。過量的使用磷肥不僅造成肥料肥效降低、作物收益減少、作物品質下降等問題，還引起水土安全隱患[6, 7]。因此農業生產中，需要根據作物種類科學選擇合適的磷肥以及合適的施肥量。

目前附子以陜西、四川和云南等地為主產地，經筆者走訪，當地藥農在附子栽培過程中大量使用磷肥，但施用的磷肥種類和效果各異。科學選擇磷肥在最大可能提高附子產量與品質的同時，對于降低磷肥的施用量、保護水土安全意義重大。而目前關于附子對磷肥種類的偏好和用量上缺乏系統研究。基于此，本研究在盆栽條件下，研究了三種磷肥在不同施肥水平下對附子產量、農藝性狀以及品質的影響，以期為附子合理施加磷肥提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試附子種質：試驗前一周自附子道地產區漢中采挖附子種根，挑選無焦巴、霉爛、鋤傷、水漩及缺芽的大小均一的二級種根用于試驗。種根經形態學鑒定及薄層色譜鑒定[8]為A.carmichaeliDebx.的子根。

主要試驗試劑：甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸均購于美國Fisher Chemical，生物堿對照品均購于成都曼斯特生物科技有限公司，磷酸二氫鉀(P2O5=52%)購于什邡華蓉科技有限責任公司，過磷酸鈣(P2O5=18%)購于山東科達化肥有限公司，鈣鎂磷肥(P2O5=17%)購于廣西鹿寨化肥有限責任公司，碳酸氫銨、硫酸鉀、以及其余試劑均購于天津天利化學試劑有限公司。

主要試驗儀器：島津LC-2030高效液相色譜儀(日本島津株式會社)，Tecan Infinit® F50酶標儀(上海帝肯貿易有限公司)。

1.2 試驗設計

2017年10月在陜西師范大學長安校區試驗田進行盆栽試驗。首先，將除去草根、石頭等雜物并充分攪拌均勻的中性壤土裝入直徑35 cm、高40 cm的塑料盆中，共裝100盆。再將所有盆施入等量的氮肥(NH4HCO3：21.33 g和鉀肥(K2SO4：2.097 g)。隨后將這些盆隨機分為10組，每組10個重復，隨機選取一組作為不施任何磷肥的空白對照組，剩余9組以P2O5含量為基準按照表1方案進行施肥處理。

表1 磷肥試驗方案

1.3 農藝性狀測定

所有附子于2018年10月15日采挖。采挖前，量取附子株高和莖粗，采挖后統計每個植株的附子個數，將附子洗凈、晾干后，測量其最大附子直徑、最小附子直徑、最大附子重量和最小附子重量。

1.4 附子產量、可溶性蛋白含量、多糖含量測定

統計完附子農藝性狀后，隨機取4個植株的附子，放置于60 ℃的烘箱中烘干至恒重，稱量干重并計算出每株產量。隨后將干燥后的附子粉碎過100目篩，攪拌均勻，取適量粉末用考馬斯亮藍法[9]測定其可溶性蛋白含量，同時取部分粉末用蒽酮-硫酸法[10]測定其多糖含量，剩余粉末在室溫下保存備用。

1.5 附子生物堿測定

采用高效液相色譜法(HPLC)測定生物堿含量。

1.5.1 液相色譜條件 色譜柱為Venusil XBP C18 (L)，規格為4.6 mm×250 mm×5 μm。

流動相A液為含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液，B液為乙腈。

洗脫程序：柱溫35 ℃；流速1 mL/min；進樣量10 μL；梯度程序為0 min時0%B液，3 min時8%B液，10 min時20%B液，15 min時25%B液，30 min時50%B液。

1.5.2 對照品制備 精密稱取鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、宋果靈、多根烏頭堿、棍掌堿、塔拉薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿這12種標準品，分別置于25 mL容量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，配制成濃度為0.5 mg/ml的標準品對照溶液。取上述12種對照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸溶液定容至25 mL，得混合對照品貯備液。

1.5.3 供試品制備 將附子干燥、粉碎、過100目篩后混勻。精密稱取附子粉末1.0 g，加入5 mL 0.05 mol/L鹽酸溶液，搖勻，超聲30 min，于3 000 r/min離心10 min。精密量取上清液0.5 mL，用甲醇定容至2.5 mL，用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.5.4 建立標準曲線 取對照品儲備液適量，用色譜甲醇稀釋成不同濃度梯度的對照品溶液，在擬定的HPLC條件下測定。以待測物的質量濃度為橫坐標X，待測物的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，計算各生物堿回歸方程及其相關系數。

1.5.5 方法學驗證 精密度試驗、穩定性試驗、重復性試驗、加樣回收率試驗參考唐進法文章[11]進行驗證。

1.6 數據分析方法

采用Excel 2019、SPSS 23、GraphPad Prism 8進行組間差異分析，綜合評價分析。

2 結果與分析

2.1 附子農藝性狀結果

表2為不同處理下的附子農藝性狀。從表2中可以看出，莖粗、單株附子個數、最小附子直徑在各處理下雖有變化但彼此間無顯著差異(P>0.05)。與對照組相比，株高在低水平鈣鎂磷肥處理下顯著增長(P< 0.05)，其余處理均無顯著變化；最大附子重量在低、中水平鈣鎂磷肥處理下增加最多，但與對照組相比無顯著差異；最大附子直徑在中水平鈣鎂磷肥處理下最大，低水平鈣鎂磷肥處理次之，但與對照組相比均無顯著差異。最小附子重量在施肥后全部減少，以中水平鈣鎂磷肥處理下減少的最少，且與對照組相比無顯著差異，其余處理與對照相比均顯著減少。

表2 不同處理下的附子農藝性狀

2.2 附子產量、可溶性蛋白含量、多糖含量結果

圖1為不同處理下的附子產量、可溶性蛋白含量和多糖含量。在產量方面，高水平磷酸二氫鉀處理下產量最高，中水平鈣鎂磷肥產量次之，兩者與空白對照組相比均顯著增加。在低水平過磷酸鈣處理下產量最低，高水平鈣鎂磷肥處理次之，與對照組相比均極顯著減少(P< 0.01)。在可溶性蛋白含量方面，與對照組相比其在所有處理下均增加，除高水平磷酸二氫鉀、高水平過磷酸鈣處理無顯著差異外，其余處理都為顯著增加，且以低水平磷酸二氫鉀處理增加最多。在附子多糖含量方面，與對照組相比低、中、高水平磷酸二氫鉀處理的附子多糖含量均為極顯著增加，其余處理均有減少，其中以高水平鈣鎂磷肥處理減少最多，為極顯著減少。

圖1 不同處理下的附子產量(A)、可溶性蛋白含量(B)、多糖含量(C)

2.3 附子生物堿含量結果

2.3.1 附子生物堿標準曲線與液相色譜方法學驗證結果 附子各生物堿標準曲線回歸方程及其相關系數結果見表3。

方法學驗證結果見表3，其中精密度試驗結果顯示12種生物堿精密度RSD在1.05%～3.99%之間，穩定性試驗RSD在1.38%～4.89%之間，重復性試驗RSD在1.38%～4.23%之間，加樣回收率試驗回收率在97.64%～101.75%之間，RSD在1.01%～4.53%之間，這些表明該方法精密度良好，重復性良好，且供試品溶液在在24 h內基本穩定。

表3 生物堿含量回歸方程、相關系數以及方法學驗證

2.3.2 附子生物堿含量結果 表4為不同處理下的各種生物堿的含量。與對照組相比，其中鹽酸多巴胺在處理后全部顯著增加，且以低水平鈣鎂磷肥處理增加最多，高水平磷酸二氫鉀處理次之；去甲豬毛菜堿除在中水平磷酸二氫鉀處理略有減少、高水平鈣鎂磷肥處理顯著減少外，其余處理下均增加，且在低、中水平鈣鎂磷肥處理下顯著增長，并以中水平鈣鎂磷肥處理增加最多；宋果靈則在處理后全部顯著降低，其中以中水平磷酸二氫鉀、低、中水平鈣鎂磷肥處理降低最少；多根烏頭堿在處理后除高水平磷酸二氫鉀輕微增長外，其余皆為顯著增加，且以中水平鈣鎂磷肥、高水平過磷酸鈣處理下增加最多；棍掌堿在低、中水平磷酸二氫鉀處理下降低，其余處理下均增加，其中低、高水平過磷酸鈣、低水平鈣鎂磷肥處理顯著增加；塔拉薩敏在處理后只有中水平過磷酸鈣、低、中水平鈣鎂磷肥略有增加，其余均為減少，但整體無顯著差異；苯甲酰新烏頭原堿除在低、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著減少外，其余處理下均顯著增加，以低水平鈣鎂磷肥增加最多；苯甲酰烏頭原堿除在低、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著增加外，其余處理下變化不大；苯甲酰次烏頭原堿在處理后均顯著增加，以中水平鈣鎂磷肥處理增加最多，低水平鈣鎂磷肥次之；新烏頭堿在在低、中水平鈣鎂磷肥處理下增加最多，高水平鈣鎂磷肥處理下減少最多，但整體上均無顯著差異；烏頭堿在中水平鈣鎂磷肥處理下顯著增加，其余處理均減少，其中在高水平過磷酸鈣、高水平鈣鎂磷肥、中水平磷酸二氫鉀處理下顯著減少；次烏頭堿除在低、中水平鈣鎂磷肥處理后無顯著變化外，其余處理均顯著降低，并以高水平鈣鎂磷肥減少最多。

表4 不同處理下的附子生物堿含量 (mg/g)

整體來看，總雙酯型生物堿在處理后，除高水平鈣鎂磷肥顯著減少外，其余處理下雖有所減少，但都無顯著差異，并以中、低水平鈣鎂磷肥處理減少最少；總單酯型生物堿在處理后均上升，除低水平磷酸二氫鉀無顯著差異外，其余均顯著增加，其中以低水平鈣鎂磷肥增加最多；總生物堿在處理后均有所增長，其中中水平鈣鎂磷肥、低水平過磷酸鈣、低水平鈣鎂磷肥、高水平過磷酸鈣處理下顯著增加，其余處理無顯著差異。

2.4 主成分分析結果

通過SPSS軟件，將所有試驗附子的產量、株高、多糖含量、鹽酸多巴胺含量等22項指標的數據采取標準化處理進行主成分分析。以特征值大于1提取了六個主成分，其累積方差貢獻率為89.542%，可代表原始數據的絕大部分信息，其中主成分特征值及方差貢獻率見表5，成分矩陣見表6。

表5 主成分的特征值及方差貢獻率

表6 成分矩陣

表7 得分及排名

以綜合得分來看，不施磷肥的對照組排名最低，施加低、中、高水平磷酸二氫鉀的排名為第6、7、3，施加低、中、高水平過磷酸鈣的排名為5、4、8，施加低、中、高水平鈣鎂磷肥的排名為2、1、9。

3 討論

3.1 不同處理對附子農藝性狀和產量的影響

在本試驗中，筆者發現施加了高水平磷酸二氫鉀的單株附子個數最多，并且產量為最好。施加了中水平鈣鎂磷肥的附子個頭最大，產量也有明顯提升。而施加了過磷酸鈣后的附子產量全部降低。

筆者推測可能是由于磷酸二氫鉀作為一種特殊的磷肥，在高水平處理時引入了一定量的鉀元素，促進附子根系的生長，使附子個頭和個數增多，從而提高了附子的產量，在戴維等人的研究中發現，鉀元素對附子有著良好的增產效果[14]，這與筆者的試驗現象吻合；鈣鎂磷肥為枸溶性磷肥[15]，肥效長，能提供一定的鈣、硅、硫、鎂等有益元素[16]，從促進附子的生長，使其性狀與產量都較好；過磷酸鈣為水溶性速效肥，其有效成分移動慢、移動距離短、易被固定的特定，其在施用時需盡量與作物根系接觸，在唐莉等人的研究中發現尿素施用過多會“燒傷”附子種根創口[17]，經查閱文獻，過磷酸鈣也有類似燒苗的現象[18]，而附子用塊根繁殖，推測施加過磷酸鈣時對附子創口造成了傷害，從而導致附子種根生長狀態差，進而引起產量降低。

整體來看，中、低水平鈣鎂磷肥和高水平磷酸二氫鉀能有效提升附子的性狀與產量。

3.2 不同處理對附子品質的影響

藥用植物的品質主要是由其化學成分決定的[19]。在當前研究中，附子可溶性蛋白作為一種潛在的有效化學成分[20]，目前研究較少。在本試驗中，附子可溶性蛋白含量在所有處理后均增加，以低水平磷酸二氫鉀處理效果最好，各水平鈣鎂磷肥處理效果也比較好，其余一般。

附子多糖具有調節免疫、保護心肌細胞、降血糖降血脂等作用[1]，是近年來的附子藥理研究的熱點。筆者在此次施肥試驗中發現，附子多糖含量在磷酸二氫鉀處理中全部極顯著增加，而在過磷酸鈣、鈣鎂磷肥組中全都降低，并在高水平時均為極顯著降低。目前有學者在研究施肥對黃精多糖含量影響時發現，磷肥對多糖的合成影響為負效應，鉀肥對多糖合成影響為正效應，同時發現黃精多糖的合成需要一個較為穩定的營養環境，施肥過多或過少均會導致多糖含量降低[21]。這與筆者的試驗現象較為一致。由此推斷，較好的多糖含量，需要在施磷肥的同時增施一定的鉀元素，且要使其保持在穩定水平。

生物堿是附子的主要藥用化學成分，具有強心、抗炎、鎮痛等多種功效[1, 22]，研究不同磷肥在不同施肥量下對其含量的影響具有重要意義。在張燕對益母草的施肥試驗[23]和鄧秋林對瓦布貝母的施肥試驗[24]中，發現施加過磷酸鈣后作物總生物堿含量增加，同時岳聰慧在土壤營養成分與附子生物堿含量的關系研究中發現，土壤速效磷與總生物堿存在顯著正相關[25]，這些表明磷肥能促進生物堿的合成，這與筆者的試驗結果一致。同時筆者在試驗中發現，中水平鈣鎂磷肥處理時，去甲豬毛菜堿、多根烏頭堿、塔拉薩敏、苯甲酰次烏頭原堿、新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿含量都比較高，且總生物堿含量最高。在低水平鈣鎂磷肥處理時，鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、宋果靈、棍掌堿、塔拉薩敏、苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿、次烏頭堿含量也比較高。由此推斷，中、低水平的鈣鎂磷肥對附子生物堿的合成具有促進效果。

3.3 基于主成分分析的附子施肥效果綜合評價

主成分分析法是一種降維分析，能將多個指標轉化成彼此相互獨立的幾個主成分，同時在轉化過程中產生能反映主成分信息量的權數。以此來計算綜合評價值，可以在一定程度上克服主觀盲目性，進而客觀地反映樣本間的真實關系[26]。

在基于主成分分析的附子施肥效果綜合評價中，中水平鈣鎂磷肥處理排名最高、低水平鈣鎂磷肥次之、高水平磷酸二氫鉀排第3。同時，不施磷肥的對照組最差，排名第10。結合前面施肥對附子農藝性狀、產量和品質的影響分析，此主成分分析清晰的將綜合施肥效果展示了出來，并且和農藝性狀、產量、品質數據相互印證。

4 結論

綜上來看，施磷肥時應首先考慮施用鈣鎂磷肥，以中水平的施肥量最好，低水平次之。同時也應注意到，施加高水平鈣鎂磷肥時，其對附子的綜合效果變差，因而要避免使用高水平的鈣鎂磷肥。因而筆者今后的研究目標將是細化鈣鎂磷肥的施肥用量梯度，以尋找最適合附子生長的最佳鈣鎂磷肥施用量。