植物抗病毒基因及其介導的抗性機理

郭子坤，劉瀚錚，李繼平

(1.甘肅農業大學 植物保護學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農業科學院 植物保護研究所，甘肅 蘭州 730070)

目前，病毒病害在農業生產上造成的危害和損失越來越嚴重。僅以馬鈴薯為例，PVX和PVY兩種病毒引起的產量損失分別達到10%和80%。由于病毒在植物細胞內寄生，所以對其防治非常困難，尚未找到理想的防治藥劑，傳統的雜交育種對此問題亦無良策。然而隨著分子生物學研究的不斷深化和基因工程技術的進一步完善，轉基因技術在培育作物抗病毒新品種方面暫露頭角。該項技術能否取得成功并走向成熟的關鍵就是植物抗病毒基因的獲取及其作用機理的研究，經過30余年的努力，這一領域成果頗豐，并將不斷取得新的進展。

1源自病毒的抗病毒基因

1.1 外殼蛋白基因

對于病毒病而言，由外殼蛋白基因介導的植物抗性首次報道于1986年，當年Powel等[1]在煙草中導入TMV基因，結果獲得抗TMV的轉基因植株。以后有學者把含有黑麥草花葉病毒(RGMV)外殼蛋白基因的CPTAG結構導入黑麥草，試驗證明，多數轉入外殼蛋白基因的植株對病毒產生抗性[2]。L3是番茄斑萎病毒(TSWV)的一個保加利亞隔離株系，Stoeva等[3]觀察了表達該株系核蛋白基因正義結構的12種商用煙草(Nicotianatabacum)栽培品種對TSWV的長期抗性，結果顯示，不論轉基因表達翻譯的產物是否達到可檢測的水平，也不論是在溫室或大田條件下，抗性均能穩定遺傳下去。Jacquet等[4]發現，含有經修飾和酶切的李子皰疹病毒外殼蛋白基因片段的轉基因植株高抗李子皰疹病毒(PPV)；他們先對兩個PPV外殼蛋白基因進行修飾和酶切，以減輕生物學上異源外殼化風險，再將這兩種結構通過農桿菌導入Nicotianabenthamiana植株；在第一個結構中刪除了蚜傳PPV病毒所含有的編碼DAG三聯體氨基酸的9個核苷酸，在第二個結構中，PPV外殼蛋白基因首位420個核苷酸被去掉。Sherman等[5]將3種番茄斑萎病毒外殼蛋白基因結構通過土壤農桿菌的轉化作用導入菊花(Dendranthemagrandigqoracv. Polaris)，這3種結構分別包含一個全長的外殼蛋白基因(PTSWVN+)；一個外殼蛋白基因，但編碼截去頂端的外殼蛋白(PTSWVNt)；一個反義翻譯的全長外殼蛋白基因(PTSWVN-)，所有這些均來自大麗花屬分離物TSWV(TSWV-D)。 對 152PTSWVN+、37PTSWVNt和47PTSWVN-轉導植株的插條進行初步抗性篩選，所用的高毒、異源TSWV毒株(TSWV-GB)分離自菊花或由薊馬(Frankliniellaoccidentalis)接種。通過篩選剔除大多數TSWV感病轉基因株系。3輪機械接種抗性試驗表明，一個PTSWVNt和兩個PTSWVN-轉導株系沒有表現系統癥狀，也沒有病毒量上的積累。6個其他株系(包括一些PTSWVN+株系)未表現一個或多個TSWV毀滅性壞死癥狀(莖潰瘍和頂芽壞死)，而且在癥狀表現上出現延遲現象。可發現在菊花上不論正義和反義結構均可增強其對TSWV的抗性。分子分析顯示，高抗TSWV的PTSWVNt株系沒有可檢測的外殼蛋白水平。所有3個抗性株系有低水平的外殼蛋白基因轉錄本，而且在它們的基因組中至少有3個轉基因插入位點，盡管感病株系的插入位點與此相似。

近年來，國內學者在外殼蛋白基因介導的植物抗病性研究方面也做了大量工作。劉佳等[6]將番茄不孕病毒(TAV)和菊花B病毒(CVB)的外殼蛋白TAV-CP與CVB-CP基因的部分片段，拼接成CBT基因，構建植物表達載體，該項研究對今后培育抗病毒菊花品種意義重大。田莉莉等[7]為獲得抗病毒的轉基因植物新材料，采用PCR方法克隆獲得489 bp的ASPV外殼蛋白基因的保守片段，得到Phe-ASPV，將其轉入EHA105，得到植物遺傳轉化工程菌EH-ASPV。王建輝等[8]在pBI121 質粒 35S 啟動子后插入具有發夾結構的葡萄病毒A(GVA)外殼蛋白基因片段后轉化EHA105，農桿菌瞬時浸潤本氏煙葉片 5 d 后發現，對照組植株表現黃化癥狀，而瞬時表達病毒外殼蛋白基因的處理組植株癥狀不明顯。2020年有報道[9]稱，得到表達CWMV CP基因的煙草Nicotianabenthamiana，導入的 CP 基因使煙草對CWMV 的抗性顯著增強。

CP介導的抗性作用機理比較復雜，尚未有統一的模型可加以解釋。目前主要有4種觀點：①CP的表達抑制了病毒的脫殼。②由于轉基因在細胞大量表達CP蛋白，病毒裸露核酸入侵后，被其迅速包裹，從而阻止了核酸的復制。③阻斷病毒粒子的擴展與運轉。④轉入的CP基因在植物細胞表達mRNA，它們與病毒RNA相互作用，以此產生抗性。

1.2 病毒復制酶基因

在關于病毒復制酶介導的抗性研究中，有學者將PEBV(豌豆早褐病毒)復制酶核酸片段導入煙草，結果發現：在100 u g/mL的接種量下，成功轉入復制酶基因的植株仍高度抵抗病毒[10]。目前，復制酶介導的保護作用已在10多個病毒屬中得到研究[11]，涉及13種病毒。

對于病毒復制酶基因介導的抗性，多數學者接受的解釋有兩種：①認為轉入的復制酶基因在植株體內的表達反向調控了病毒復制，使復制率明顯降低；②認為象噬菌體Qβ那樣，轉入的復制酶基因在植株體內表達突變的復制酶，可能與復制酶的野生型發生競爭，打亂了病毒復制，因此使植物產生抗病毒能力[12]。

1.3 病毒運動蛋白基因

Tacke等[13]研究發現，表達黃矮病毒屬的17 ku MP突變體馬鈴薯，不僅抵抗黃矮病毒的侵染，而且抵抗PVX和PVY的侵染。Cooper等[14]獲得含有突變的TMV運動蛋白基因的轉基因煙草植株，攻毒試驗表明，轉基因植株對煙草花葉病毒組等多個病毒組的病毒具有廣譜抗性。另有學者得到表達P24蛋白的轉基因煙草植株(NicotianatabacumXanti D8 NN)，P24蛋白是3個交結在一起的PVX局部運動蛋白之一。體內有最高水平P24蛋白積累的植株顯示矮化和輕微褪綠表現型。這些轉基因植株可使PVX突變體(該突變體在P24蛋白上產生一個移碼突變)在細胞之間的移動更加容易。用TMV接種后，P24+植株上的局部壞死病斑顯著小于未轉化的對照植株；當用Ob病毒(Ob病毒能夠躲避N基因引起的過敏性反應)接種后，已轉化的植株在系統抗性方面表現明顯，未觀察到系統癥狀；而且Western免疫病斑分析和回接分析均表明，病毒的積累保持低水平或無法檢測到病毒[15]。Cui等[16]在中國7個地區隨機采集的166份(21.1 %)李樣品中，檢測到35份呈現PNRSV陽性，15個分離株的運動蛋白基因(MP)具有82.9%～99.9 %的核苷酸序列同源性，對MP基因序列采用系統發育分析，結果顯示分離物PV96、PV32和PE5為3個明確的系統發育群，該結果對MP基因介導抗性的研究有參考價值。劉曉玲等[17]采用PVX為研究對象，將其運動蛋白基因(PVX-p25)轉化煙草NC89，經篩選和PCR檢測，共獲得轉非翻譯PVX-p25的轉基因植株78株，結果表明，其中的31株對PVX具有高度抗病，比例達到39.7%。

由于轉入植物體內的MP基因所表達的MP蛋白不具備病毒MP蛋白的功能，但它們與野生型病毒MP具有競爭關系，競相爭奪位于胞間連絲上的結合位點，從而阻礙病毒粒子在宿主體內的轉移與擴散。

2 與病毒基因相關的其他基因序列

2.1 病毒衛星RNA

衛星RNA是多核苷酸，它們往往存在于輔助病毒中，依據輔助病毒的復制與傳播機理，從一個植株傳到另一個植株，它們與作為其宿主的輔助病毒核苷酸異源，對病毒的復制也不起作用，但是衛星RNA可以改變其輔助病毒致病力。

衛星RNA最初由Kaper發現。Stommel等[18]把表達黃瓜花葉病毒的一個改良衛星RNA導入兩種易感基因型，獲得3株轉基因番茄植株。對它們進行兩個生長季節的觀察，以評估其病毒癥狀、效價、衛星RNA的表達及果實產量。結果發現，轉基因植株表現較輕或無CMV癥狀且效價較低(與未轉化植株相比)。轉基因植株上衛星RNA水平與病害嚴重程度之間存在明顯負相關關系。CMV病毒感染的衛星轉基因植株總的可銷售產量比CMV感染的父母本植株提高40%～84%。尤其是，轉基因植株產量與父母代植株無顯著性差異。風險評估證明，在試驗場所范圍內衛星RNA傳播水平較低且無對周圍植物造成危害的證據。Taliansky等[19]選用花生叢病毒(GRV)弱毒衛星RNA的全長序列，將其導入本生煙，獲得轉基因植株，當GRV和強毒衛星RNA接種時，轉基因植株未顯癥。顧沛雯等[20]的研究發現，利用CMV的衛星RNA生防制劑S52免疫辣椒，田間對比試驗顯示，免疫接種50 d的防效達71.2%～84.2%，免疫接種80 d的防效達55.9%～70.2%，由此可見，CMV衛星RNA作為抗病毒基因材料，在辣椒抗病毒轉基因育種方面亦將大有作為。

衛星RNA介導的抗性機理尚未完全搞清。一般認為，可能由于競爭病毒RNA復制酶而誘發抗性。

2.2 正義與反義RNA

反義RNA和正義RNA均可介導植物的抗病性。Tavert等[21]曾設計了兩種李樹水痘病毒(PPV)的Pl基因結構，隨后將這兩種P1基因通過農桿菌導入Nicotianabenthamiana植株，當用PPV病毒接種時，轉基因植株或免疫或恢復感染。生化分析結果表明，抗性表現型與轉基因轉錄的水平相關聯。Scharer等[22]把花椰菜花葉病毒(CaMV)35S RNA先導序列導入煙草而獲得抗病毒的轉基因植株；他們還研究了在轉基因煙草植株體內35S RNA先導序列對下游 葡糖苷酸酶(GUS)報告基因表達的影響。Marano等[23]的研究發現，含有煙草花葉病毒Ul株系(TMV Ul)開放閱讀框(ORF)基因的轉基因植株可抵抗TMV-U1的入侵；但它們不抗十字花科植物的TMV病毒株系，然而這些轉基因植株對含有54 ku開放閱讀框(ORF)的PVX卻產生抗性，無論該ORF是正向或反問嵌入。蔡群芳等[24]構建RNA正義、反義表達載體并導入農桿菌，獲得相應的農桿菌工程菌株，對以后開展番木瓜抗PRSV育種工作奠定了基礎。

RNA介導的抗性存在復雜的相互作用過程，反義RNA表現的抗性可能是因轉基因RNA與病毒RNA直接相互作用所致，這種相互作用有不同的組織特異性RNA表達(Harnmond等，1995);正義RNA則通過交叉保護機制干擾病毒的復制，也有人認為正義RNA具有與原編碼蛋白一致的ORF，但在植物體內的轉錄不能翻譯出有功能的蛋白，從而達到抗病毒的目的。

2.3 缺陷干擾顆粒

缺陷干擾顆粒(Defective interfering particles，DIP)是不能自身進行復制的缺陷病毒，但具有干擾同種成熟病毒進入細胞的能力。DIP最早是由Huang于1970年提出，它存在于多種動物病毒和植物病毒中，是病毒的一種分子寄生物。盡管衛星RNA也屬于分子寄生物，但二者與其宿主的來源不同，DIP與其宿主病毒核酸同源，可它在病毒核酸中有不連續體。DIP本身不能增殖，也不能產生干擾性病毒，但當DIP序列在轉基因植株中表達時，其與接種病毒競爭復制，從而干擾接種病毒的復制。Imad等[25]發現，經黃網病毒缺陷干擾顆粒轉化處理的Nicotianaedwardsonii，接種 SYNV(苦苣菜黃網病毒，SonchusYellow Net Virus)5個月后，用電鏡檢查煙株，在葉片和根細胞中均未觀察到病毒粒子。Marsh等發現，用BMV的RNA2構建DIP，其在大麥原生質體內對病毒復制產生干擾。

DIP干擾病毒復制的機理為：①DIP對RNA聚合酶的親和力大于正常病毒的親和力，在核酸復制過程中，兩者競爭導致正常病毒不能有效結合RNA聚合酶而使子代病毒產量下降；②由于DIP缺損了一段核酸，因此，在復制過程中，它比正常病毒更快，占用了大量的RNA聚合酶而干擾了正常病毒的復制；③阻礙病毒的包裝、釋放和入侵[26]。

2.4 核酶基因

1981年Cech和Alfman在研究四膜蟲mRNA前體的剪接時，首次發現核酶。Kidmtop等[27]認為，核酶可與相應的特異序列RNA底物結合，具有切割功能。Natsoulis等于1991年提出可將CP和核酶連接構成融合蛋白，組裝成病毒外殼，因它具有核酶活性，可在特定條件下特異降解病毒核酸，達到抗病毒的目的。Feyter等[28]則將核酶和反義基因相結合轉化煙草，發現轉基因植株對TMV抗性較高。Yang等[29]根據馬鈴薯紡錘塊莖類病毒(Potato spindle tuber viroid)基因組的特定區域序列設計核酶基因，并將之導入馬鈴薯植株，結果表明轉基因植株高抗馬鈴薯紡錘塊莖類病毒。

在國內，劉力等[30]則設計合成了特異切割水稻條紋葉枯病毒RNA保守區及編碼病害特異性蛋白(Disease specific protein，DSP)基因的核酶，兩種核酶基因長度均為40個堿基，序列測定表明，克隆得到的核酶序列與設計的核酶序列完全一致，在體外均具有特異性切割活性，為培育在水稻體內切割病毒RNA分子的轉基因抗病毒品種提供了思路。另外，還有孔衛青等[31]、張劍峰等[32]分別克隆對桑花葉萎縮類病毒及馬鈴薯卷葉病毒具切割能力的核酶基因，并獲得轉錄載體，為通過基因工程手段培育桑樹和馬鈴薯抗病毒品種做了有益的前瞻性探索。

3 源自植物的抗病毒基因

植物在長期與病毒相互斗爭的過程中形成一套對付病毒等病原物侵染的防御機制，也就是說植物本身存在抗性基因，通過這些基因的表達，可產生某些特定的蛋白質以抗拒病毒入侵。雖然目前人們對植物抗病毒基因賦予植物抗性的機理了解較少，但將這些基因導入植物以獲得抗病毒轉基因植株無疑具有廣闊前景。

3.1 潛在自殺基因

在植物潛在自殺基因方面，N基因的研究已有成效，有研究表明，含有N基因的煙草在接種TMV后能誘發過敏性壞死性反應(Whitham等，1994)。其他植物潛在自殺基因的研究鮮見報道。

潛在自殺基因本來就屬于植物基因，只是它在正常情況下不引發植物細胞的死亡，比如在普通品種中表現隱形，在野生品種中表現顯性，只有顯性情況下一旦遭遇入侵病毒，發生互作時才引發宿主細胞凋亡，保護附近健康的植物細胞不被感染。

3.2 病程相關蛋白基因

當植物遭受病毒及病原物侵染后，植株便會產生一類病程相關蛋白(PR)，PR蛋白由植物自身編碼。PR蛋白可分為5組，第1組與植物對病毒的抗性有關，如辣椒攜帶的ya(pr21)抗性基因對PVY和TEV具有有效的抗性，當辣椒植株受到侵染時，病毒在侵染細胞內增殖，不能產生系統性的擴散(Hinrichs等，1997)。植物轉入病程相關蛋白基因后，其介導的抗性機理可能與轉基因表達的PR蛋白參與植物細胞壁抗侵染有關，也可能與它們協調作用有關。

3.3 核糖體失活蛋白基因

核糖體失活蛋白(RIP)廣泛存在于高等植物中，有兩種類型：I型為單鏈堿性蛋白質，分子量約為30 ku，II型為由A、B兩條肽鏈通過二硫鍵組成的二聚體，分子量約為60 ku。RIP主要具有RNA N-糖苷酸酶活性，有些RIP則以其核酸酶(RNase)活性起作用。美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)是一種RIP蛋白，從美洲商陸(Phytolaccaamericana)葉片中分離出得到，其分子量約30 ku，Lodge等[33]對轉PAP基因植株進行攻毒試驗，結果表明，轉基因植株對多種病毒表現抗性。Krishnan等[34]對另一種核糖體失活蛋白基因(天花粉蛋白基因)的研究顯示，表達天花粉蛋白前體基因的植株對CMV和TMV系統侵染癥狀具有遲滯作用，局部的枯斑數量亦減少。范琦等[35]克隆出新的玉米RIP基因，該基因序列長983 bp，其中編碼區長828 bp，共編碼275個氨基酸和一個終止密碼子，GC含量為58.3%。林毅等[36]從傳統中草藥絞股藍中分離出一種新型核糖體失活蛋白，該蛋白對煙草花葉病毒具有抗性；他們還得到13個核糖體失活蛋白基因序列，為培育抗病作物新品種提供了新的基因資源。

4 植物抗體基因

雖然植物缺乏動物那樣的免疫系統，對病毒不能產生抗體，然而可將源自動物的中和病毒之抗體基因導入植物，使植物也能表達中和抗體，以抵抗病毒侵染。植物抗體基困可分為3個基本類型，即嵌合抗體基因、改形抗體基因和小分子抗體基因[37]；Tavladoraki等[38]的研究發現，將scFv抗體基因導入煙草后，細胞質表達scFv的轉基因植株可抵抗菊芋斑紋病毒(AMCV)的侵染。劉德虎等[39～42]的試驗證實，3個雜交瘤細胞系(D73、D90和A69)產生的單克隆抗體均能與PVYO、PVYN及PVYC發生親和性反應，以D73為最強。侵染抑制試驗表明，經D73單克隆抗體處理后的病毒接種物，其在Solanumdemissum×S．Tuberosum離體葉片引起枯斑的能力顯著受到抑制。他們在此基礎上構建了馬鈴薯Y病毒中和抗體基因文庫，從基因文庫中篩選輕鏈和重鏈基因陽性克隆，并分析了輕、重鏈基因的序列，構建了其植物表達載體。

5 干擾素基因

脊椎動物細胞在受到病毒感染后能合成并分泌干擾素，干擾素(Interferon)是一種具有高度生物活性的調節細胞功能的多功能蛋白，分子量較小，能結合在細胞質膜上，并導致抗病毒態的形成。最初發現于流感病毒，后從煙草、番茄、番椒、丁香等植物中也分離出干擾素(Fantes，1975)。國外有學者將大鼠體內編碼干擾素之一的2'，5'-寡腺苷酸合成酶基因導入馬鈴薯植株，結果用PVX攻毒時，轉基因植株葉與塊莖中病毒濃度顯著低于對照植株(未轉化)[10]。中國學者已將人的-干擾素基因導入煙草和水稻中并得到表達，表達的干擾素具有抗病毒活性。宋莉等[43]對轉干擾素基因ChIFN- 煙草植株進行TMV接種試驗，結果證明轉入的基因賦予陽性植株對TMV的抗性。

6 結語

植物抗病毒基因介導的抗病性為培育抗病品種并從根本上防治植物病毒病害開辟了一個全新的領域。自1986年Powell等獲得首株轉基因抗病毒植株以來，眾多研究人員在該領域不斷推進，成績斐然，新的抗病毒基因資源不斷被發現，轉化的植物種類越來越多，轉基因的遺傳穩定性越來越高。然而，通過對這一領域研究工作的簡略概括，不難發現仍有不足之處，因此，今后的研究工作應側重以下幾個方面：①植物抗病毒基因資源的分類與整理工作；②植物抗病毒基因介導的抗性分子基礎；③抗病毒轉基因在植物體內表達的影響因子(如轉基因的重組、沉默等)；④新的抗病毒基因的發掘特別是源于植物自身的抗病毒基因的開發與利用；⑤在明確抗性機理后如何開展抗病毒基因的人工智能化設計與克隆；⑥抗病毒轉基因的生態安全性與遺傳穩定性。