RNA結合蛋白CSTF2通過調控MCM6促進HCC細胞的增殖和遷移

何曉燕 張強弩 宰國真 楊柳 王桂芝

肝癌是全球發病率第六位的惡性腫瘤，同時也是全球第四位的癌癥致死病因[1]。原發性肝癌的85%～95%是肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)，由于起病隱匿加之早期診斷措施不夠完善，HCC中晚期患者的死亡率高達80%，中位生存期不足1年、5年生存率不足20%[2]。因此，有必要進一步探索HCC的分子機制，找到與HCC相關的關鍵分子，從而助力于HCC早期診斷、治療靶點的確定、患者的個體化治療及預后判斷。

RNA結合蛋白(RNA-binding proteins，RBP)是參與轉錄后調控事件的重要蛋白，憑借多變的RNA-binding區域和靈活的結構，RBP以動態的形式控制了很多RNA的代謝行為，包括RNA的剪接、定位、轉運及穩定性維持[3-4]。目前，已經明確RBP可以通過轉錄后調控等作用參與腫瘤的發生發展。研究已經證實，癌組織和癌旁組織中存在一些RBP的表達差異，并且這種差異表達與患者的預后及臨床特征相關，這些證據提示RBP可能作為腫瘤治療的重要靶點[5]。切割刺激因子(cleavage stimulation factor 2，CSTF2)是RBP的一種，它可以結合靶基因mRNA的3'非翻譯區(3’-UTR)內的富含GU的元件，對3’-UTR進行修剪，從而使靶基因的表達和活性出現變化[6]。但是在HCC中，CSTF2的作用還不清楚。本研究發現CSTF2在HCC中呈現高表達，高表達的CSTF2預示著患者的不良預后。在體外細胞試驗中，筆者對CSTF2的功能進行了研究，發現CSTF2在體外具有促癌作用。同時本研究發現CSTF2與微小染色體維持蛋白6(minichromosome maintenance complex component 6，MCM6)具有表達上的相關性，因此在分子機制方面筆者假設HCC中CSTF2可能通過調控MCM6發揮作用。體外細胞試驗表明，CSTF2確實可以增加MCM6表達，并通過MCM6促進HCC細胞的增殖和轉移。綜上，本研究表明CSTF2具有成為HCC分子治療靶點的潛力。

材料和方法

一、主要試劑

Huh7肝癌細胞購自中國科學院上海生命科學研究院；胰酶及胎牛血清購自美國GIBCO公司； Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒及Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自上海翊圣生物公司；Lipofectamine 2000及 Lipofectamine RNAiMax購自美國Thermo Fisher公司；CCK-8細胞活力試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒RIPA裂解液和ECL發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。引物由廣州金唯智公司提供，siRNA-MCM6購自由廣州銳博生物公司；siRNA陰性對照購自美國Qiagen公司。

二、公共數據收集

9個不同中心的HCC隊列mRNA微芯片數據(GSE14520, GSE22058, GSE25097, GSE36376, GSE45436, GSE64041, GSE76427, GSE54236及GSE63898)集通過Gene Expression Omnibus數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載。2個中心的HCC隊列RNA測序數據(TCGA-LIHC及ICGC-LIRI-JP)通過Integrative Molecular Database of Hepatocellular Carcinoma(HCCDB，http://47.95.203.196/database/hccdb/home.html)數據庫檢索并下載。各隊列癌組織和癌周組織的mRNA表達差異使用R軟件及Limma程序包進行分析。

三、臨床樣本和免疫組織化學染色

收集20例在接受治療并進行手術切除的HCC癌組織和對應癌周組織的石蠟包埋組織樣本。所有病例均經過病理學確診，其中男性患者15例，女性患者5例。包埋組織切片后進行免疫組織化學染色，一抗使用兔抗人多克隆CSTF2抗體(1∶150)，二抗使用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔lgG抗體。辣根過氧化物酶顯色試劑盒進行顯示處理后，評估癌組織和癌周組織的CSTF2陽性率。

四、細胞培養及細胞轉染

肝細胞癌Huh7細胞常規培養于37 ℃、5% CO2培養箱。培養基采用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基。取對數期細胞進行試驗。CSTF2的上調采用體外轉染pcDNA3.1-CSTF2過表達質粒的方式實現，同時采用pcDNA3.1空質粒作為陰性轉染對照。MCM6的下調采用轉染siRNA-MCM6的方式實現，采用All star?無關序列作為陰性轉染對照。質粒的轉染采用Lipofectamine 2000試劑，同時siRNA的轉染采用Lipofectamine RNAiMax試劑。

五、CCK-8細胞活力試驗

將轉染好的細胞按照每孔3 000個的密度種植于96孔板后繼續培養24 h。待細胞貼壁后(設定為0 h點)，使用CCK-8細胞活力試劑盒檢測0、24、48及72 h各組細胞的活力變化。檢測時棄去培養孔原有培養基，每孔加入100 μL CCK-8試劑(1∶10)，37 ℃放置 1 h后測量450 nm處吸光度。按照公式(增殖率=其他時間點吸光度/0時間點吸光度)計算各組細胞的增殖情況。

六、劃痕試驗

將轉染好的細胞按照每孔100 000個的密度種植于12孔板后繼續培養24 h。待細胞貼壁后使用無菌的移液器吸頭進行劃痕，劃痕后立即在倒置顯微鏡下進行拍照。繼續培養48 h后再次進行拍照。Image J軟件(版本號1.53)計算各時間點的劃痕面積，比較各組的細胞遷移速度。

七、實時熒光定量PCR分析(qRT-PCR)

各組樣本的總RNA樣本通過TRIzol?試劑進行提取。使用Hifair?Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis反轉錄試劑盒對獲取的總RNA樣本進行反轉錄以獲取cDNA模板。使用Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix熒光定量PCR試劑盒對獲取的cDNA進行定量擴增，內參使用GAPDH。興趣基因的相對表達水平采用2-△△CT法計算，其中△CT=CT目標-CT內參。CSTF2的引物序列為上游：5′-TCACTGCGTT-CCGTGTTCG-3′，下游：5′- CCCTTGGGTTTTC-CCGTCTC-3′。MCM6的引物序列為上游：5′-GA-GGAACTGATTCGTCCTGAGA-3′，下游：5′-CA-AGGCCCGACACAGGTAAG-3′。GAPDH的引物序列為上游：5′- TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′，下游：5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

八、Western blot分析

使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取各組細胞樣本的總蛋白。BCA蛋白定量試劑盒對蛋白樣本定量后與5X上樣緩沖液進行混合，使用聚丙烯酰胺凝膠對對蛋白樣本進行電泳分離，將蛋白印跡轉移到醋酸纖維薄膜。5% 脫脂奶粉室溫封閉2 h。兔抗人CSTF2、MCM6及GAPDH (內參)多克隆抗體進行一抗孵育，過夜后，PBST洗滌膜3遍，進行辣根過氧化物酶標記的羊抗兔lgG二抗孵育2 h。ECL化學發光色后進行條帶檢測。

九、統計學分析

結 果

一、CSTF2在肝癌組織中的表達特點

筆者首先收集了9個不同中心HCC隊列的mRNA微芯片數據以及2個中心HCC隊列的mRNA測序數據。通過比較這些數據集中癌組織和癌周組織的mRNA表達差異，發現在這些隊列的HCC患者癌組織中CSTF2的mRNA均呈現高表達(P<0.05)。CSTF2的mRNA在各隊列中的表達情況見圖1A。免疫組織化學提示CSTF2在HCC癌組織中呈現高表達(圖1B)，其中在癌組織中的陽性表達率為75%，在癌周組織中僅為30%，差異具有統計學意義(P<0.05)。

A.CSTF2 mRNA在9個HCC mRNA芯片數據集和2個測序數據集中的表達情況；B.免疫組織化學染色檢測CSTF2在HCC患者癌組織和癌周正常組織中的表達×100

二、CSTF2與肝癌患者臨床病理特征及預后的關系

接下來筆者將TCGA-LIHC數據集中的患者以及GSE14520數據集中的患者按照CSTF2 mRNA的水平中位值進行了分組，并且比較了兩組患者之間的臨床病例特征(表1和表2)。CSTF2表達水平與HCC患者的腫瘤尺寸、AFP水平、TNM分期、BCLC分期、CLIP分期及侵襲風險密切相關(P<0.05)。在TCGA-LIHC和ICGC-LIRI-JP隊列中，較高的CSTF2表達水平(以mRNA水平的中位值為截斷值)預示著較差的總體生存率(P<0.05,圖2A-B)。在GSE14520中，可以發現在早期CSTF2水平似乎與患者生存率無關，但是在中晚期，較高CSTF2水平的患者總體生存率較低(圖2C)。在TCGA-LIHC隊列中較高的CSTF2水平預示著較低的無病生存率(圖2D)。

表1 TCGA-LIHC數據集中CSTF2 mRNA水平與患者臨床特征的關系

表2 GSE14520數據集中CSTF2 mRNA水平與患者臨床特征的關系

三、肝癌細胞中CSTF2通過調控MCM6的表達發揮對HCC細胞的增殖和遷移促進作用

基于HCCDB數據庫的整合，HCC隊列的共表達分析提示MCM6與CSTF2存在共表達關系(圖3A)。筆者在9個HCC隊列的mRNA微芯片數據以及2個中心HCC隊列的mRNA測序數據中對CSTF2和MCM6的mRNA表達情況作了相關性分析，結果發現除GSE63898外，在其他隊列的癌組織中CSTF2均與MCM6的表達存在顯著的正相關性(圖3B)。

A.TCGA-LIHC數據集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關系；B.ICGC-LIRI-JP數據集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關系；C.GSE14520數據集中CSTF2 mRNA水平與患者總體生存率的關系；D.TCGA-LIHC數據集中CSTF2 mRNA水平與患者無病生存率的關系

A.以CSTF2為核心的的基因共表達網絡；B.11個HCC數據集中肝癌組織內的CSTF2 mRNA水平與MCM6 mRNA水平的相關性；C.轉染CSTF2過表達質粒的Huh7細胞中CSTF2及MCM6的mRNA變化；D.轉染CSTF2過表達質粒的Huh7細胞中CSTF2及MCM6的mRNA變化。*表示與pcDNA3.1空質粒轉染的細胞相比，P<0.05

在Huh7細胞中，轉染表達pcDNA3.1-CSTF2質粒可以有效提高CSTF2的表達水平，同時可以觀察到CSTF2過表達后，細胞MCM6 mRNA和蛋白水平也出現增加(圖3C及圖3D)。過表達CSTF2后，筆者發現Huh7細胞的增殖加快(圖4A)，同時轉移能力也加強(圖4B)。轉染MCM6的siRNA后，可見CSTF2的促增殖和促遷移效果被抵消(圖4A-4B)。siRNA-MCM6效敲減細胞的MCM6 mRNA及蛋白表達的效果見圖4C及圖4D。

A.轉染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7細胞的增殖能力變化；B.轉染CSTF2及siRNA-MCM6后Huh7細胞的遷移能力變化；C.siRNA-MCM6轉染有效降低Huh7細胞的MCM6 mRNA水平D.siRNA-MCM6轉染有效降低Huh7細胞的MCM6 蛋白水平。*表示與陰性轉染混合物(pcDNA3.1空質粒+Allstar陰性轉染對照)或Allstar陰性轉染對照的細胞相比，P<0.05

討 論

RNA結合蛋白可以結合促癌基因或抑癌基因的RNA從而調控這些基因RNA的剪接、定位、轉運及穩定性，從而參與促癌基因和抑癌基因RNA的動態平衡[7]。RNA結合蛋白的表達和功能異常會打破抑癌基因和促癌基因的動態平衡，最終導致腫瘤的發生發展。因此，探討RBP與腫瘤發生的關系及其分子作用機制，對發現新的腫瘤標志物或者潛在的分子治療靶點意義重大。HCC是全球范圍內死亡率極高的惡性腫瘤之一，治療效果及預后極差。既往的一些研究揭示了RBP與HCC的關系。比如Zhao等[8]發現了42個與HCC進展相關的RBP，其中RPS3在肝癌組織中的豐度較高。進一步的研究發現，RPS3可以通過與SIRT1的RNA結合，從而穩定SIRT1的RNA表達，而SIRT1具有促癌作用。因此通過這個機制RPS3發揮促進HCC的作用。Yang等[9]報道了另一個RBP PTBP3在HCC的作用，他們的研究發現，PTBP3可以調控NEAT1和pre-miR-612的RNA剪切平衡從而促進HCC的增殖和轉移。

然而，大多數RBP在HCC進展中的生物學功能和機制尚不清楚，更多與HCC有關的RBP需要被鑒定并進行深入研究。基于這個需求，筆者在前期工作中收集了9個不同中心HCC隊列的mRNA微芯片數據進行了秩聚合算法的整合，共涉及病例1 000余例。通過對上述大數據的整合和挖掘筆者鑒定到了34個RBP在肝癌組織和癌周組織間存在顯著的表達差異，其中包括CSTF2。本研究發現，CSTF2在11個中心(9個芯片數據集和2個測序數據集)的HCC數據集中都呈現出在肝癌組織中的過表達，提示CSTF2在HCC中可能扮演一定的角色。但是目前還沒有任何研究報道CSTF2在HCC中的作用和機制。不過已經有少量證據提示CSTF2在其他腫瘤中的作用，并且這些證據都提示CSTF2具有促癌作用，機制可能為CSTF2對其靶基因RNA 3’-UTR的結合剪切作用使得這些基因的3’-UTR縮短，從而使得靶基因的表達或活性發生了變化。比如Chen等[10]發現膀胱癌細胞中CSTF2可以與RAC1的3’-UTR結合，從而導致RAC1的3’-UTR區域縮短，使得RAC1不能和一些microRNA結合，間接導致RAC1的mRNA水平增加。通過這個機制CSTF2在膀胱癌發揮促癌作用，同時高CSTF2和其引起的一些靶基因的3’-UTR區域縮短可能成為膀胱癌患者的預后較差的標志物。Akman等[11]的研究指出，在乳腺癌中EGF能夠引起CSTF2的上調，后者可以引起大量增殖相關靶基因的3’-UTR縮短事件。

本研究首先探討了CSTF2的表達水平和HCC患者預后及其他臨床特征的關系。基于公共大數據的mRNA表達譜及相關臨床數據，筆者發現較高的CSTF2 mRNA預示著較差的HCC患者預后，且較高CSTF2 mRNA水平的HCC患者出現較大腫瘤尺寸、較高AFP水平、較晚TNM分期及血管侵襲的比例較高。在蛋白水平，筆者通過免疫組化分析發現CSTF2的蛋白水平在癌組織中明顯升高，來自human protein atlas數據庫的免疫組化結果與筆者的數據一致，也提示CSTF2在癌組織中呈現高表達。這些證據提示CSTF2在HCC中可能發揮促癌作用。接著在體外細胞試驗中筆者對CSTF2的功能進行了驗證，發現過表達CSTF2后，肝癌Huh7細胞的增殖加快且遷移速度加快，這提示CSTF2在HCC中的確具有促癌作用。接著筆者嘗試找到HCC中受CSTF2調控的靶基因，通過基于多個HCC隊列的相關性分析發現MCM6與CSTF2在HCC癌組織中具有較強的相關性，因此MCM6很可能受CSTF2的調控。MCM6是參與DNA復制啟動的重要因子，它與其他5個MCM蛋白家族的成員形成聚合物后可以啟動DNA的復制，從而參與腫瘤細胞的增殖，較高的MCM6表達提示增殖活躍。MCM6的促癌作用已經在HCC得到了報道，比如Liu等[12]的研究發現MCM6可以促進HCC細胞的S/G2比例，從而增加增殖，提示患者的不良預后。另一項研究則表明，MCM6通過MEK/ERK通路促進HCC的轉移[13]。但是MCM6的上游調控機制還未見有報道，MCM6在HCC中增高的原因仍然需要探討。在體外細胞研究中，筆者發現在高表達CSTF2后，MCM6的mRNA和蛋白表達均出現了上調，提示CSTF2能夠增加MCM6的表達。在過表達CSTF2的同時敲減MCM6的表達，可以觀察到CSTF2的促癌作用減弱了，提示CSTF2的促癌作用部分是通過MCM6實現的。基于既往報道的CSTF2 RNA結合功能，本研究推測CSTF2可能是通過縮短MCM6的3’-UTR，從而導致MCM6不被一些microRNA降解，間接引起MCM6的表達增高。這一假設需要在后期研究中進行驗證。

總之，本研究發現CSTF2在HCC的癌組織中存在顯著的過表達并預示著患者的不良預后；CSTF2可能通過調控MCM6的表達來發揮促進HCC細胞增殖和遷移的作用；CSTF2和MCM6有望成為HCC診斷的分子標志物或者治療的分子靶點。