大鼠肝臟組織不可逆電穿孔消融能量效應和熱效應研究

朱金俊， 黃偉偉， 包家立， 胡亞楠

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要儀器

清潔級Sprague-Dawley大鼠（浙江省醫學科學院實驗動物中心提供），平均體質量200 g。所有實驗過程均符合我國《實驗動物管理條例》有關條規。

實驗儀器主要有電脈沖系統OX4-5型電穿孔儀（杭州場皿科技公司），脈沖電場發生的簡要示意電路如圖1所示，由電源、電容器組、開關和脈沖控制器、并行電阻及負載組成；YP5008G型多路溫度記錄儀（深圳永鵬儀器公司）。

圖1 脈沖發生電路

1.2 IRE消融

電脈沖處理前以1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將脈沖發生器、電極針進行連接，用鐵架臺固定電極針，針間距為5 mm；大鼠以躺姿固定于手術臺，手術區域消毒并暴露肝臟；將電極垂直插入大鼠肝中，施加電脈沖。實驗分為11組，脈沖個數分別為10、20、30、40、50、60、70、80、100、120、140個，每組總能量分別為5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70 J。脈沖釋放結束后將臟器回納腹腔，常規閉腹并消毒。

1.3 實時溫度測量

通過熱電偶測溫儀分別測量肝臟組織在電脈沖暴露時的實時溫度。熱電偶放置的測量點如圖2所示。共設置15個測量點，測量點1～5放置于電極針中上側，間距為2.5 mm；測量點6～10放置于電極針右側，間距為2.5 mm；測量點11～15放置于電極針的右下側，間距為2.5 mm。

圖2 熱電偶儀測量點示意圖

1.4 病理檢查

飼養3 d后，對大鼠行安樂死。將肝組織置于4%甲醛溶液中浸泡48 h，石蠟包埋，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，制成組織切片并行蘇木精-伊紅（HE）染色，通過Olympus VS200數字切片掃描儀進行掃描，獲得病理學彩色掃描圖。通過ImageJ軟件進行消融面積計算。

1.5 溫度仿真

表1 仿真參數

1.6 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件分析結果，以均值±標準誤表示，n=3，取平均值進行比較，P＜0.05為差異有統計學意義。采用GraphPad Prism 8軟件繪制圖表。

2 結果

2.1 IRE引起肝臟消融的病理組織學觀察

組織消融情況如圖3所示，消融區域邊界清晰。消融1區域是插入深度約為2 mm、直徑為0.35 mm的電極針所在區域；2區域是靠近電極的組織被熱損傷區域，肝組織結構消失，呈現均勻的紅色染色固化狀態，中心電極溫度達到組織熱固定閾值（圖3②）；3區域肝組織結構保留，但肝核消失，肝竇擴張，顯示有Kupffer細胞殘留（圖3②④）；4區域是修復與再生結合區，大量肉芽組織形成，5區域中肝細胞輕度受損，呈細胞水腫狀態（圖3③）。電場暴露引起的消融部位鄰近血管和膽管仍保留完整（圖3⑤）。

圖3 肝臟消融3 d后組織學所見

2.2 IRE能量效應

實驗發現，電脈沖能量＜20 J時肝臟組織消融面積隨能量逐步增加，最大消融面積約為30 mm2；電脈沖能量＞20 J后，肝臟組織消融面積不再繼續增大（圖4）。不同能量的組織HE染色切片代表圖如圖5所示。

圖4 能量與肝臟組織消融面積關系

圖5 不同能量組織HE染色切片代表圖（10×）

2.3 IRE熱效應

大鼠肝臟溫度15個測量點（圖2）實時數據如圖6所示，實驗發現在能量為0.5 J、釋放頻率為1 Hz電脈沖下，肝臟溫度在50 s內快速上升，在50～150 s進入緩慢上升，在150～200 s溫度趨于穩定（圖6①）；在能量為0.25 J、頻率為1 Hz和0.5 J，頻率為0.5 Hz電脈沖作用下，肝臟溫度在100 s內上升，在100～200 s溫度趨于穩定（圖6②③）。用Sim4Life軟件根據具體電脈沖參數對大鼠肝臟溫度分布進行仿真（圖7），可見距離電極越近的區域，溫度越高；電極針附近等溫線接近圓形，隨著距離增加逐漸變成葫蘆狀，最終呈橢圓形分布；越靠近電極，溫度變化率越大。將15個測量點仿真溫度和實驗測量最終溫度進行對比，數值高度吻合（圖8）。

圖6 不同參數脈沖暴露下肝臟溫度實時變化曲線

圖7 不同參數脈沖暴露下肝臟仿真溫度分布圖

圖8 電脈沖作用下測量最終溫度和仿真溫度對比

3 討論

IRE消融技術是除了射頻消融［15-16］、微波消融［17-18］、光熱 消融［19］、激光消 融［20］、冷 凍消融［21-22］之外另一種良惡性腫瘤消融方法，具有可應用于血管、膽管、胰管和神經等重要組織結構附近良惡性腫瘤消融的優勢［23］，也可使肝血管肝門得以保留［24］。IRE已成為肝門等重要結構附近良惡性腫瘤安全消融治療的手段之一。然而，IRE在組織消融中的能量效應和熱效應仍有待進一步研究。本研究通過觀察IRE處理后肝臟組織病理學切片發現，肝臟消融區域與周圍組織有明顯分界，且區域內細胞發生凝固性壞死，這說明IRE能引起肝組織消融并限定在一定范圍，提示IRE應用于肝臟組織消融的有效性；同時發現IRE在組織消融過程中可避開鄰近血管和膽管，具有保護敏感部位優勢（圖3⑤），這提示只要給予的能量合適，IRE對于重要結構周圍良惡性腫瘤的消融具有安全性。

目標組織溫度高于45～50℃這一“致死溫度范圍”20 s后組織就會被高溫破壞［13］。本實驗中采用0.5 J單脈沖能量，以0.5 Hz頻率進行釋放，實時測量目標組織溫度變化，最高溫度位于5號測量點處，約為40℃，比實驗前提高約10℃（圖6③）。通過測量不同電參數IRE處理時肝臟組織溫度實時變化，均發現溫度逐漸上升，并最終趨于穩定；在相同脈沖頻率下，當能量增加時，組織溫度也會相應增加（圖6①②），同時在相同能量條件下，當脈沖頻率增加時，組織溫度也會相應增加（圖6①③）。根據電脈沖具體參數進行溫度分布仿真模擬發現，其與實驗得出的最終溫度高度吻合（圖8）。實驗和仿真結果共同表明，IRE治療過程中熱效應是存在的，所以需要在手術前根據電脈沖體參數充分預測IRE暴露后組織熱量分布。

本研究旨在探索IRE在大鼠肝臟組織消融中的能量效應和熱效應，結果顯示消融部位肝臟組織發生凝固性壞死，消融區域與周邊組織存在明顯分界，血管膽管未見明顯損傷。IRE在肝臟消融中存在能量效應，并可得出對應的能量效應經驗公式，同時IRE也會引起組織熱效應。因此，應在術前優化電參數，確定IRE最優能量，并避免產生熱損傷。