基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對接技術(shù)分析清眩降壓湯治療高血壓的作用機(jī)制

張媛潔，許 文，吳水生，3*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122；3.福建省中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)開發(fā)基地，福建 福州 350122）

高血壓（hypertension，HTN）在中醫(yī)學(xué)上歸屬于“眩暈”“頭痛”范疇，其中醫(yī)病名為“風(fēng)?！?，病位在心、肝、脾、腎，病性有實(shí)有虛，也有虛實(shí)夾雜。風(fēng)眩分為肝火上炎、痰濕內(nèi)阻、瘀血內(nèi)阻、陰虛陽亢、腎精不足、氣血兩虛、陰陽兩虛等證型［1］。清眩降壓湯（Qingxuan Jiangya Decoction，QXJYD）是國醫(yī)大師陳可冀院士治療HTN 肝腎陰虛、肝陽上亢證的經(jīng)驗(yàn)方，由苦丁茶、天麻、黃芩、牛膝、生杜仲、夜交藤、鮮生地黃、桑葉、菊花和鉤藤組成，具有補(bǔ)益肝腎、清泄肝熱、平抑肝陽的功效，主治肝陽上亢型HTN 引發(fā)的眩暈、頭痛、睡眠障礙等癥，療效確切［2-3］。此外，該方也可控制SHR 大鼠血壓的升高，減輕由HTN 引發(fā)的心肌肥厚。前期研究表明：QXJYD 抑制SHR 大鼠血壓升高以及主動脈血管重構(gòu)的主要機(jī)制與其活性成分能夠降低血清中AngⅡ、ET-1 含量和RPA 活性水平以及抑制血管平滑肌細(xì)胞中PCNA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的蛋白表達(dá)有關(guān)［4］。然而，QXJYD 治療HTN 的作用機(jī)制尚未明晰，仍有待進(jìn)一步闡明，因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)系統(tǒng)地探討QXJYD 治療HTN 的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 QXJYD活性成分及作用靶標(biāo)的獲取 采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫（https：//tcmspw.com/tcmsp.php），以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18 作為閾值，對QXJYD 活性成分進(jìn)行篩選，并檢索數(shù)據(jù)庫

TCMID（http：//negabionet.org/tcmid/）、ETCM（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、BATMAN-TCM（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫（http：//www.organchem.csdb.cn/scdb）對QXJYD 的活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。通過DrugBank（https：//www.drugbank.com）和BATMAN-TCM 數(shù)據(jù)庫識別與QXJYD 活性成分相關(guān)的作用靶標(biāo)，合并兩數(shù)據(jù)庫所獲的作用靶標(biāo)，剔除重復(fù)項(xiàng)，借助UniProt 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）校正靶標(biāo)基因名，設(shè)置基因來源為“Human”，獲取QXJYD 活性成分作用靶標(biāo)。

1.2 HTN 作用靶標(biāo)的獲取 在GeneCards（http：//www.genecards.org）、DisGeNET（https：//www.disgenet.org）和TTD 數(shù)據(jù)庫（https：//www.disgenet.org）中，以“hypertension”作為關(guān)鍵詞檢索HTN 的作用靶標(biāo)。為提高準(zhǔn)確性，GeneCards 中靶標(biāo)按相關(guān)分值由高到低排序，并以分值大于中位數(shù)作為篩選條件，篩選2 次，僅保留排序靠前的作用靶標(biāo)，最后以三者并集非重復(fù)靶標(biāo)作為HTN 作用靶標(biāo)。

1.3 QXJYD-HTN 交集靶標(biāo)韋恩圖的構(gòu)建 利用Venny 2.1.0 在線繪圖工具繪制韋恩圖，對QXJYD活性成分作用靶標(biāo)與HTN 作用靶標(biāo)相映射，獲得QXJYD 治療HTN 的交集靶標(biāo)。

1.4 活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 利用Cytoscape 3.7.1 軟件對所獲活性成分與交集靶標(biāo)進(jìn)行活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，篩選度值（DC）從大到小排序的前20 的活性成分作為主要活性成分。

1.5 交集靶標(biāo)蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將交集靶標(biāo)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//stringdb.org），將物種設(shè)為“Homo Sapiens”，最低閾值設(shè)為≥0.900，舍棄與其他靶標(biāo)無相互作用的孤立靶標(biāo)，進(jìn)行PPI 分析；將分析所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建交集靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)，并通過MCODE 算法，默認(rèn)參數(shù)設(shè)置，對整個PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行聚類，識別得到交集靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)中潛在的各個子網(wǎng)絡(luò)；最后將交集靶標(biāo)的接近中心性（CC）、中介中心性（BC）和DC 分別從大到小排序，以三者大于各自中位數(shù)作為篩選條件，篩選2 次［5-6］，保留符合條件的交集靶標(biāo)作為關(guān)鍵靶標(biāo)。

1.6 GO 生物功能分析與KEGG 通路富集分析 將交集靶標(biāo)導(dǎo)入基因富集分析工具（Metascape，http：//metascape.org/），物種設(shè)置為“H.sapiens”，其他參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置，對交集靶標(biāo)分別進(jìn)行GO 的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）與分子功能（MF）分析以及KEGG 通路富集分析。

1.7 分子對接 為進(jìn)一步探究QXJYD 對HTN 的調(diào)控作用，選取主要活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。借助PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取主要活性成分的小分子配體，用Chem3D 軟件對其優(yōu)化力學(xué)結(jié)構(gòu)，并在AutoDock-Tools 軟件中檢測配體root、選擇配體可旋轉(zhuǎn)鍵；隨后，利用RCSB-PDB 數(shù)據(jù)庫（http：//www.RCSB.org/）獲取關(guān)鍵靶標(biāo)的蛋白受體，使用PyMoL 軟件移除關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白受體結(jié)構(gòu)中的水分子以及小分子配體，并導(dǎo)入AutoDockTools 軟件中進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、添加原子類型的處理，根據(jù)二者作用位點(diǎn)，確定對接區(qū)域；最后，使用AutoDock Vina 軟件進(jìn)行分子對接來獲取二者的最低結(jié)合能，并利用PyMoL 軟件對分子對接結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1 QXJYD 活性成分與作用靶標(biāo)信息 借助中藥數(shù)據(jù)庫，獲取活性成分142 個，見表1。通過化合物信息數(shù)據(jù)庫獲取作用靶標(biāo)，經(jīng)UniProt 數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化后，最終得到364 個活性成分作用靶標(biāo)。

表1 QXJYD“中藥-活性成分-作用靶標(biāo)”基本信息

2.2 HTN 作用靶標(biāo)信息 通過疾病數(shù)據(jù)庫，獲取HTN 作用靶標(biāo)2 313 個。

2.3 QXJYD-HTN 交集靶標(biāo)韋恩圖 通過Venny 2.1.0 在線繪圖工具，確定231 個交集靶標(biāo)，見圖1。

圖1 QXJYD-HTN 交集靶標(biāo)維恩圖

2.4 活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果 利用Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該圖包含373 個節(jié)點(diǎn)（142 個活性成分和231 個交集靶標(biāo)節(jié)點(diǎn)），2 445 條邊。由圖2 可知：QXJYD 每個活性成分均能與一個或多個靶標(biāo)相互作用，體現(xiàn)了其多成分、多靶標(biāo)間協(xié)同作用的機(jī)制。表2 展示了按照藥物歸屬以及根據(jù)DC 從大到小排序的前20 的主要活性成分，如槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇等，這些主要活性成分可能在治療HTN 中發(fā)揮一定的功效。

表2 QXJYD 主要活性成分相關(guān)信息

圖2 活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 交集靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)的分析結(jié)果 通過Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建交集靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)，見圖3，該圖具有201 個節(jié)點(diǎn)，986 條邊。運(yùn)用MCODE 算法獲取3 個分別以CXCL8、SRC、EGFR 為核心的緊密聯(lián)系的子網(wǎng)絡(luò)，見圖4～圖6，推測QXJYD 可能通過上述子網(wǎng)絡(luò)之間的聯(lián)合作用治療HTN。最后，以CC、BC 和DC 三者排序大于中位數(shù)作為篩選條件，對含201 個節(jié)點(diǎn)，986 條邊的交集靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行一次篩選，構(gòu)建一個具有66 個節(jié)點(diǎn)和458 條邊的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，同法進(jìn)行二次篩選，構(gòu)建一個具有21個節(jié)點(diǎn)和109 條邊的關(guān)鍵靶標(biāo)PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，篩選過程見圖7，獲得關(guān)鍵靶標(biāo)相關(guān)信息見表3。

圖3 交集靶標(biāo)的PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 以CXCL8 為核心的子網(wǎng)絡(luò)

圖6 以EGFR 為核心的子網(wǎng)絡(luò)

圖7 關(guān)鍵靶標(biāo)篩選流程圖

由表3 可知：QXJYD 活性成分可能通過作用于靶標(biāo)磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α（PIK3CA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、SRC 激酶（SRC）、絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT1）、絲裂原活化蛋白激酶3（MAPK3）、激活子蛋白-1（JUN）、腫瘤抑制蛋白p53（TP53）、腫瘤壞死因子（TNF）、磷酸化細(xì)胞核因子（RELA）、表皮生長因子受體（EGFR）、白介素6（IL-6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、鈣黏著蛋白關(guān)聯(lián)蛋白（CTNNB1）、血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）、絲裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、雌激素受體α（ESR1）、CXC 主題趨化因子配體8（CXCL8）、表皮細(xì)胞生長因子（EGF）、F2、糖皮質(zhì)激素受體基因（NR3C1）、白介素4（IL-4）治療HTN。

表3 QXJYD 治療HTN 的關(guān)鍵靶標(biāo)相關(guān)信息

圖5 以SRC 為核心的子網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 生物功能分析及KEGG 通路富集分析 GO生物功能分析涉及BP、CC 和MF 分析，將各自基因數(shù)排名前10 位的GO 條目繪制成柱狀圖，見圖8。由圖8 可知：GO 生物功能分析主要涉及細(xì)胞對氮化物的反應(yīng)、對細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、血液循環(huán)、細(xì)胞組分、細(xì)胞質(zhì)膜、氧化還原酶活性、蛋白質(zhì)同二聚化活性、蛋白域特異性結(jié)合等方面。KEGG 通路富集分析主要涉及MAPK 信號通路、TNF 信號通路、HIF-1信號通路等220條HTN相關(guān)信號通路。KEGG通路富集分析信號通路見表4（相關(guān)靶標(biāo)僅展示關(guān)鍵靶標(biāo)）。

表4 QXJYD 治療HTN 的KEGG 通路富集分析

圖8 交集靶標(biāo)的GO 生物功能分析圖

2.7 分子對接驗(yàn)證 本研究使用分子對接軟件Autodock vina 對DC 排名靠前的10 個主要活性成分槲皮素、β-谷甾醇、黃芩素、天麻素和異鉤藤堿等與5 個關(guān)鍵靶標(biāo)AKT1、IL-6、SRC、TNF、VEGFA 進(jìn)行分子對接驗(yàn)證，最低結(jié)合能計(jì)算結(jié)果見表5。選用結(jié)合能較低的黃芩素與SRC、天麻素與VEGFA進(jìn)行分子對接可視化展示，見圖9。一般認(rèn)為結(jié)合能＜0 kcal/mol 的配體與受體可自發(fā)結(jié)合［7］，結(jié)合能≤-5.0 kcal/mol 說明活性成分與作用靶標(biāo)之間有較好的結(jié)合活性。而結(jié)合能越小，則說明小分子配體與靶標(biāo)蛋白受體的構(gòu)象形狀匹配越接近，結(jié)合能力越強(qiáng)，能量也越低［8］。表5 顯示：所有主要活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)的最低結(jié)合能均≤-5.0 kcal/mol，提示篩選出的關(guān)鍵靶標(biāo)與對應(yīng)的主要活性成分之間對接構(gòu)象穩(wěn)定，具有較好的結(jié)合活性。其中，齊墩果酸與AKT1、IL-6、VEGFA，大黃素與SRC，黃芩素與TNF 結(jié)合能最小，對接構(gòu)象最穩(wěn)定，結(jié)合能力最強(qiáng)。結(jié)合圖9 的分子對接可視化結(jié)果可知：關(guān)鍵靶標(biāo)能夠與主要活性成分自發(fā)結(jié)合并借助氫鍵等分子間作用力形成較穩(wěn)定的對接構(gòu)象。

表5 主要活性成分和關(guān)鍵靶標(biāo)的分子對接結(jié)果

圖9 QXJYD 主要活性成分-關(guān)鍵靶標(biāo)對接的可視化展示

3 討 論

通過活性成分-交集靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)分析得到20 個主要活性成分，包含β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素、黃芩素和天麻素等。實(shí)驗(yàn)表明：β-谷甾醇具有抗炎作用，其作用機(jī)制可能與減少NO 的合成，減少炎性因子IL-1、IL-6、TNF 等的分泌，抑制游離細(xì)胞遷移等有關(guān)［9］；山柰酚和槲皮素同屬于黃酮類化合物，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗氧化的作用［10-11］；黃芩素通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS 蛋白表達(dá)與NO 釋放增強(qiáng)乙酰膽堿對血管的舒張作用，從而有效地?cái)U(kuò)張血壓，達(dá)到降壓的目的［12］；天麻素能降低循環(huán)中的AngⅡ，增加NO 含量，具有舒張血管，增強(qiáng)主動脈和大動脈等血管的彈性，以及改善血管內(nèi)皮功能的作用，從而達(dá)到降壓的目的［13］。由此可見，QXJYD主要活性成分是通過抗炎、抗氧化和舒張血管等功能來實(shí)現(xiàn)治療HTN 的作用。

通過PPI 網(wǎng)絡(luò)分析得到21 個關(guān)鍵靶標(biāo)，包含MAPK1、SRC、AKT1、VEGFA 和JUN 等。MAPK1 與AKT1 為血管內(nèi)皮障礙相關(guān)靶標(biāo)，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與血管生成，與HTN 的發(fā)生密切相關(guān)［14］；SRC 參與VEGF 誘導(dǎo)的NO 和PGI-2 生成，可認(rèn)為SRC 參與了VEGF 調(diào)節(jié)血管張力、舒張血管以及降壓的過程［15］；VEGFA 與血壓升高呈正相關(guān)，其與血管損傷、動脈粥樣硬化密切相關(guān)，是預(yù)測和治療HTN 的重要指標(biāo)［16］；JUN 是激活子蛋白-1（AP-1）的組成之一，活化的AP-1 可以調(diào)控炎癥因子，如IL-6、TNF 等的表達(dá)，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞及炎癥細(xì)胞的增殖，血管阻力增加從而導(dǎo)致血壓升高，故認(rèn)為JUN 在治療HTN，特別是在免疫抗炎方面發(fā)揮著重要的作用［17］。

通過KEGG 通路富集分析可知：關(guān)鍵靶標(biāo)主要富集在MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 等信號通路上，這些通路與細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。研究表明MAPK 活性的增加與HTN 表型密切相關(guān)，內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及局部AngⅡ、ET-1 和NO 的交互作用在維持血管結(jié)構(gòu)方面具有重要作用，它們產(chǎn)生的分子機(jī)制與MAPK 信號通路密切相關(guān)［18］；TNF 信號通路與炎癥反應(yīng)有關(guān)，TNF 信號通路異常調(diào)節(jié)會導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，平滑肌細(xì)胞增生，血管外周阻力增加而引起HTN［19］；PI3K-Akt信號通路可通過下調(diào)NF-κB、HIF-1、CasP9 等蛋白因子的表達(dá)，通過發(fā)揮降低炎癥反應(yīng)，減少細(xì)胞凋亡等功能，達(dá)到治療HTN 的目的［20］。以上內(nèi)容提示，MAPK、TNF、HIF-1、PI3K/Akt 信號通路在研究HTN 的發(fā)生發(fā)展中均占有重要位置。

本研究采用分子對接技術(shù)對QXJYD 主要活性成分與關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。結(jié)果顯示：主要活性成分均能與關(guān)鍵靶標(biāo)具有較好的結(jié)合活性。該結(jié)果說明QXJYD 可能通過槲皮素、黃芩素和天麻素等主要活性成分作用于AKT1、SRC 和VEGFA等關(guān)鍵靶標(biāo)，從而達(dá)到治療HTN 的效果。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法和分子對接技術(shù)系統(tǒng)地揭示了QXJYD 治療HTN 的作用機(jī)制，反映了QXJYD 對HTN 多成分、多靶標(biāo)、多途徑的調(diào)控理念。但本研究是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)的挖掘，許多活性成分、疾病靶標(biāo)以及生物學(xué)過程仍有待開發(fā)，為進(jìn)一步研究其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，將基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的初步探討與體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證相結(jié)合，才能真正說明網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。