基于網絡藥理學探討清化腸飲治療潰瘍性結腸炎作用機制

韓育英，曹劉菁，柯 曉，彭 軍，沈阿靈*，陳友琴，4*

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學附屬第二人民醫院，福建 福州 350003；4.美國凱斯西儲大學醫學院，俄亥 俄州克利夫蘭 44106）

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因不明的直腸和結腸慢性非特異性炎癥性疾病［1］，其在北美洲和歐洲的發病率分別為24.3/10 萬和19.2/10 萬，在我國乃至亞洲地區，UC 發病率也呈明顯上升趨勢［2］，但其發病機制尚不明確，一般認為是遺傳、環境、腸道菌群、免疫應答等多種因素相互作用的結果［3-4］。目前治療UC 臨床常用藥以糖皮質激素、水楊酸制劑、免疫抑制劑為主［5］，盡管這些藥物短期療效良好，但長期使用存在一定的毒副作用［6］，因此，尋找更加安全有效的UC 治療藥物顯得尤為重要。

中醫學對UC 病名雖無記載，但根據其臨床表現，認為UC 屬“泄瀉”“久痢”“腸癖”等范疇，病機以脾腎虧虛為本虛，以濕熱、瘀血、熱毒為標實［7］。劉河間在《素問玄機原病式》指出：“諸瀉痢皆屬于濕，濕熱甚于腸胃之內，而腸胃怫郁，以致氣液不得宣通而成”［8］，可見，濕熱在UC 發病中占有重要地位。清化腸飲（QHCY）是國醫大師楊春波教授治療UC 大腸濕熱證的經驗方，由仙鶴草、地榆、黃連、赤芍、白豆蔻、厚樸、茵陳、佩蘭、薏苡仁、白扁豆、茯苓11 味藥組成，具有清熱化濕、收斂止血、止痢、瀉火解毒、健脾的功效［9］，臨床研究證實QHCY 治療濕熱型UC 療效確切［10］。前期基礎研究表明：QHCY 能夠通過抑制UC 相關炎性因子的分泌以緩解炎癥，維持腸上皮細胞的緊密連接水平以修復腸黏膜機械屏障［11-12］。然而，QHCY 在UC 治療中的作用機制仍有待進一步闡明，因此，本研究擬通過網絡藥理學預測和揭示QHCY 治療UC 作用機制。

1 方 法

1.1 QHCY活性成分收集與篩選 采用中藥系統藥理學平臺（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［13］，在“herbname”檢索框中分別以“仙鶴草”“地榆”“黃連”“赤 芍”“白豆 蔻”“厚 樸”“茵陳”“佩蘭”“薏 苡仁”“白扁豆”“茯苓”為檢索詞，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30% 和 類 藥 性（druglikeness，DL）≥0.18 作為篩選依據［14］，篩選出11 味中藥活性成分信息。

1.2 QHCY 的作用靶點預測 采用TCMSP 數據庫對篩選出的QHCY 活性成分進行蛋白靶標獲取，然后將獲得的蛋白靶標導入Uniprot 數據庫（http：//www.Uniprot.org/），轉化成統一的基因名，設置基因來源為人源性，從而獲得QHCY 活性成分的作用靶點［15］。

1.3 QHCY 治療UC 作用靶點的收集 在DisGeNET數 據 庫（http：//www.disgenet.org/）［16］和GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）［17］中以“ulcerative colitis”為關鍵詞，檢索UC 的靶點，去除重復項后，與QHCY 活性成分的作用靶點相映射，得到QHCY 治療UC 的共同靶點，即作用靶點。

1.4 活性成分-共同靶點網絡構建與QHCY 治療UC 關鍵活性成分的獲取 將共同靶點及對應的活性成分導入到Cytoscape 3.7.2 軟件中，構建出活性成分-共同靶點網絡圖，并導出相關拓撲數據，篩選大于平均度值（degree）的節點，得到QHCY 治療UC 的關鍵活性成分。

1.5 構建靶點相互作用（PPI）網絡圖 將QHCY 與UC 的共同靶點導入String 數據庫，物種設置為“homo sapiens”，設定置信度＞0.9，其余參數保持默認設置，獲取相互作用關系信息表。將表中數據導入到Cytoscape 3.7.2 軟件，繪制共同靶點PPI 網絡圖，同時對網絡進行拓撲結構分析，確定QHCY 治療UC 的核心靶點［18］。

1.6 GO 和KEGG 富集分析 將共同靶點導入DAVID 數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO 和KEGG 富集分析，以P＜0.001 作為篩選條件，并且依據富集通路涉及基因數的大小，從大到小進行排名，篩選出KEGG 富集分析中排名前20 名的通路及GO 富集分析中排名前10 名的條目。

2 結 果

2.1 QHCY 活性成分及其作用靶點 運用TCMSP分析平臺，篩選出不重復而且有作用靶點的活性成分75 個，其中仙鶴草5 個，地榆9 個，黃連11 個，赤芍14 個，白豆蔻14 個，厚樸3 個，茵陳13 個，佩蘭7個，薏苡仁6 個，白扁豆1 個，茯苓6 個，見表1。利用Uniprot 數據庫確定了不重復的靶點共計241 個，見表1。

表1 QHCY 活性成分信息

續表1

2.2 QHCY 治療UC 的作用靶點 通過檢索得到UC 疾病作用靶點5 168 個，將QHCY 活性成分作用靶點與UC 疾病作用靶點相映射，得到二者共同靶點167 個。

2.3 活性成分-共同靶點網絡圖分析結果 活性成分-共同靶點網絡圖中共涉及230 個節點（即共同作用靶點及其對應活性成分的節點）和608 條節點連接線（連接線表示兩個節點之間存在相互作用），見圖1。由圖1 可知：QHCY 治療UC 并非單一成分或單一靶點的作用，而是多成分、多靶點的聯合作用?；钚猿煞止濣c的平均度值（度值表示某一個節點與其他節點的連接數，度值越大，連接的節點數越多）為9.650 794，其中有19 個活性成分節點的度值高于平均值，為QHCY 治療UC 的潛在關鍵活性成分，見表2。

圖1 QHCY 活性成分-共同靶點網絡圖

表2 QHCY 治療UC 關鍵活性成分信息

2.4 PPI網絡圖分析結果 PPI網絡圖中共有146個節點（即共同作用靶點），705 條節點連接線。將在String 數據庫中獲得的PPI 網絡數據導入Cytoscape 3.7.2 軟件，節點平均度值為9.657 534，其中轉錄因子1（JUN）、腫瘤抗原p53（TP53）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、轉錄因子p65（RELA）、絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、腫瘤壞死因子（TNF）、原癌基因蛋白（FOS）、連環蛋白β1（CTNNB1）、白介素-6（IL6）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）等61個節點度值高于平均值，即為QHCY 治療UC 的核心靶點，見圖2。

圖2 QHCY 共同靶點PPI 網絡圖

2.5 GO 富集分析 GO 富集分析顯示涉及生物過程（BP）214 個，細胞組分（CC）22 個，分子功能（MF）39 個，將排名前10 名的GO 條目繪制柱狀圖，見圖3。

圖3 共同靶點的GO 富集分析圖

2.6 KEGG 通路分析 經篩選得到87 條信號通路，且根據富集通路涉及基因數的大小，由大到小進行排名，篩選出排名前20 名的通路，見表3。

表3 KEGG 信號通路富集分析結果（前20 名）

3 討 論

QHCY 活性成分-共同靶點網絡中共篩選出19個關鍵活性成分，包括槲皮素、木犀草素、山柰酚等。槲皮素的綜合評分高于其他活性成分，具有免疫調節、抗氧化、抗炎等多種藥理作用［19］，可通過抑制炎癥因子IL-6、IL-1β 及TNF-α 的釋放和增強結腸抗氧化活性來發揮治療UC 的作用［20］；木犀草素屬于黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化和抗菌等多種藥理作用［21］，可通過抑制UC 大鼠結腸NF-κB、IL-17 和IL-23 的水平，調節腸道菌群，從而減少UC 大鼠結腸損傷［22］；山柰酚是黃酮醇類化合物的代表成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、提高機體免疫力等多種功能［23］，可通過下調UC 小鼠血清中一氧化氮與前列腺素E2的水平，增強杯狀細胞分泌黏液的功能，從而起到減輕腸黏膜損傷的作用［24］。由此可見，QHCY 篩選出來的活性成分普遍具有抗炎、抗氧化和免疫調節等功能，這可能是其治療UC 的主要藥理作用。

通過對PPI 網絡圖分析得出61 個關鍵靶點，在這些靶點中排名靠前且與UC 關系密切的靶點有JUN、TP53、AKT1、RELA 等。JUN 作用于AP-1（c-JUN）信號通路上，在炎性細胞增殖、分化過程中發揮重要作用，其表達與細胞因子、炎性介質的分泌有關［25］；TP53 是目前發現的一種重要的抑癌基因［26］，在UC 發生、發展過程中的作用尚未見報道，但已有研究表明TP53 可作為UC 患者中結腸異型增生和結腸癌篩查的生物指標，可能是治療UC 相關性結直腸癌患者的潛在靶標［27］；AKT1 具有調節細胞存活、增殖、分化及代謝等功能［28］，有研究表明活化的AKT 可以促進NF-κB 的磷酸化，抑制IκB的蛋白合成而激活NF-κB，進而增加TNF-α、IL-1β 等炎性細胞基因的轉錄，造成細胞因子IL-6、IL-8 的失衡，進而產生腸黏膜損傷［29］；RELA 作為NF-κB 的一個蛋白質亞單位，其翻譯后修飾可以調控NF-κB 的轉錄激活，并在炎癥反應相關性疾病的發生發展過程中發揮著重要作用［30］。

通過KEGG 富集分析可知：QHCY 主要通過調控PI3K/Akt、TNF、MAPK、Toll 樣受體、HIF-1 等多種信號通路而達到治療UC 的作用，這些通路與免疫應答、細胞凋亡、氧化應激和炎癥反應密切相關。PI3K/Akt 信號通路可通過激活NF-κB 這一經典炎癥通路來調控免疫和炎癥反應［31］；TNF 主要由巨噬細胞、T 細胞、樹突狀細胞等細胞分泌，參與炎癥因子生成、白細胞募集、炎性介質合成等過程［32］；MAPK 信號通路的下游包括p38、c-Jun N 端激酶（JNK）與細胞外信號調節激酶（ERK）等信號通路，MAPK 通路的活化可使其下游的p38、JNK 和ERK磷酸化，引起細胞增殖、分化及凋亡等，進而參與炎癥反應［33］；Toll 樣受體是最早發現的信號分子識別受體，可以通過誘導炎性細胞因子、趨化因子和干擾素的分泌參與炎癥反應［34-35］；HIF-1 是應答缺氧應激的轉錄因子，在炎癥疾病的發病過程中高表達［36］。有研究表明：在UC 模型大鼠結腸黏膜中HIF-1、VEGF 含量增高，進一步佐證了UC 的發生、發展與免疫失調和炎癥反應密切相關［37］。

綜上所述，本研究結果表明QHCY 可能是通過調節免疫應答、炎癥反應、氧化應激和細胞凋亡等多種途徑發揮治療UC 的作用。本研究通過網絡藥理學預測了QHCY 治療UC 的關鍵活性成分、核心靶點和信號通路，對QHCY 治療UC 的分子機制研究提供了參考，但由于本研究僅基于數據挖掘和分析，因此QHCY 對UC 治療作用的分子機制仍需通過基礎實驗和臨床試驗來驗證。