歸脾湯對慢性睡眠剝奪大鼠HPA軸功能及單胺類神經遞質的影響

張 敏，黃俊山，張一帆，曾雪愛，王秀峰，陳銘奇，張 婭

（1.福建省中醫藥科學院，福建 福州 350003；2.福建省中醫睡眠醫學重點實驗室，福建 福州 350003；3.黃俊山福建省名老中醫藥專家傳承工作室，福建 福州 350003）

慢性失眠發生與下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA）及腦內多種神經遞質密切相關，病情大多反復難愈，根治困難。歸脾湯（Gui Pi Decotion，GPD）是臨床治療心脾兩虛型失眠的經典方，廣泛應用于臨床，但其治療慢性失眠的機制尚不明確。HPA 軸是最原始的內源性晝夜節律調節系統，其中促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質激素（ACTH）和皮質醇（CORT）是HPA 軸重要的組成激素，與睡眠密切相關［1］。HPA 軸能調控腦內多種神經遞質，其失?？蓪е聠伟奉愡f質如5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）等的改變。因此，本實驗通過改良水平臺法建立大鼠慢性睡眠剝奪模型，探討GPD 對CRH、ACTH 和CORT 以及5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量的影響。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF 級SD 雄性大鼠48 只，8～9 周齡，體質量（200±20）g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號為SCXK（滬）2018-0006，在福建省中醫藥科學院比較醫學實驗中心飼養1 周。飼養環境安靜，恒溫（22±1）℃，每日12 h 固定照明（8：00 開燈），并可自由攝取食物和水，合格證號為SYXK（閩）2016-0005。本實驗獲得福建省中醫藥科學院動物倫理委員會批準（審批號：FJATCMIAEC2020010）。

1.2 藥物與主要試劑 人參、木香、遠志、當歸、白術、茯神、黃芪、龍眼肉、炒酸棗仁、炙甘草（福建省鷺燕醫藥有限公司，批號：190601、1907028077、190901、190515、1905018082、190901、190522、190808、190620、190820-010）；艾司唑侖（濟川藥業集團有限公司，批號：20200501）；CRH、ACTH、CORT 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（美國Trust Specialty Zeal公司，型號：RG-28912、R6404、RG18882）；水合氯醛（北京雷根生物技術有限公司，貨號：R00635）；5-HT、5-HIAA、NE、DA 試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21833、B27047、B24713、B25300）。

1.3 主要儀器 Rayto RT-6100 酶標分析儀（深圳雷杜生命科學股份有限公司）；Rigol L3000 高效液相色譜儀（普源精電科技股份有限公司）；Kromasil C18 反相色譜柱（荷蘭Nouryon 公司）。

2 方 法

2.1 實驗方法

2.1.1 GPD 藥液的制備 稱取人參10 g，木香10 g，遠志10 g，當歸10 g，白術20 g，茯神20 g，黃芪20 g，龍眼肉20 g，炒酸棗仁20 g，炙甘草5 g。先量取10倍總量冷水浸泡30 min，武火煮沸后文火繼續煮20 min，過濾，收集濾液；次煎再加冷水沒過中藥，武火煮沸后文火繼續煮30 min，過濾。將兩份濾液合并，濃縮至1.86 g/mL GPD 藥液。將藥液與蒸餾水分別按1∶1及1∶3稀釋，可得0.93 g、0.47 g/mL GPD 藥液。

2.1.2 大鼠慢性睡眠剝奪模型制備 將48 只大鼠隨機分為正常對照組8 只及造模組40 只，造模組大鼠均通過改良水平臺法進行慢性睡眠剝奪。參考文獻［2］，造模組大鼠每天（16：00—次日10：00）睡眠剝奪18 h，次日（10：00—16：00）放回籠內休息6 h，實驗周期為21 d。正常對照組采用大平臺實驗環境，不進行任何處理，標準化飼養。若大鼠出現白天活動增加，夜間慵懶喜臥，晝夜節律紊亂，喜靜少動，飲食減少，體質量降低，反應遲鈍，時有焦慮易激惹現象，較正常對照組明顯不同，提示模型制備成功［2］。

2.1.3 分組與給藥 除正常對照組外，將造模成功的大鼠按分層隨機分組方法分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組及艾司唑侖組，每組8 只。造模第15 天，低、中、高劑量組分別以0.47、0.93、1.86 g/mL GPD（相當于臨床人日用量的3、6、12倍），艾司唑侖組以0.009 mg/mL 艾司唑侖（相當于人臨床日用量的6倍），正常對照組及模型組以生理鹽水，均按1 mL/100 g 體質量灌胃。每天1 次，連續7 d。

2.1.4 組織標本的采集 造模后21 d 給藥后開始禁食、禁水，24 h 之后用戊巴比妥鈉（1 mL/100 g）麻醉大鼠，腹主動脈采血；后斷頭，剪開頭皮，用血管鉗揭去顱骨和硬腦膜，剪斷雙側視神經后用眼科鑷子迅速取出大鼠的整個腦組織；冰上剝離全腦，分離下丘腦和前額葉組織，用0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈，放入事先進行標號處理的錫紙包裹好，存入液氮中，轉存于-80 ℃冰箱待測。

2.2 觀察指標

2.2.1 大鼠一般狀態觀察 大鼠的精神活動狀態、皮毛顏色是否有光澤、進食飲水量、對外界刺激的反應及體質量變化等。

2.2.2 血清和下丘腦中CRH、ACTH、CORT 含量測定 將下丘腦用PBS制成10%的組織漿液，低溫離心15 min，吸取上清液；血清低溫離心15 min，吸取上清液，嚴格按試劑說明書，采用ELISA 測定血清和下丘腦組織中CRH、ACTH、CORT 含量。

2.2.3 前額葉5-HT、5HIAA、DA、NE 含量測定 稱取約0.1 g 大鼠前額葉樣本，加入0.01mol/L HCLO4溶液進行前處理，冰浴勻漿，冰水浴超聲30 min。8 000g離心10 min，取上清液，針頭式過濾器過濾后，制備成供試品溶液待測。精確稱取5-HT、5HIAA、DA、NE，分別用水溶解，定容成10 mL 配成標準品溶液后待測。色譜條件：Kromasil C18 反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相的配制：20 mmol/L 磷酸二氫鉀的水溶液，流速0.8 mL/min，柱溫30 ℃，熒光激發波長為285 nm，發射波長為318 nm。用流動相過柱子，待基線穩定后開始加樣。分別精密量取5-HT、5HIAA、DA、NE 標準品溶液、供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測定，即得。

2.2.4 統計學方法 實驗數據采用SPSS 26.0 軟件分析。計量資料符合正態分布的以（xˉ±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；不符合正態分布的以中位數和四分位數來表示，采用非參數檢驗。

3 結 果

3.1 各組大鼠一般狀態 正常對照組大鼠精神狀態佳，活動靈敏，毛發光澤干凈，飲食正常，白天慵懶喜臥，夜間興奮好動。模型組大鼠晝夜節律紊亂，精神倦怠，皮膚色澤暗淡，毛發枯燥，喜靜少動，飲食減少，體質量降低，時有焦慮易激惹現象。經治療后，GPD 各劑量組和艾司唑侖組大鼠一般狀態均有不同程度的改善。

3.2 各組大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH、CORT含量比較 血清中上述指標以中、低劑量組降低最為顯著，最接近正常對照組，下丘腦中上述指標以中劑量組降低最為顯著，最接近正常對照組。據此推測慢性睡眠剝奪大鼠會引起HPA 軸功能亢進，見表1～表2。

3.3 各組大鼠前額葉5-HT、5-HIAA、NE、DA 含量比較 5-HT 和5-HIAA 升高以中劑量組效果最佳，最接近正常對照組，NE 和DA 降低分別以高劑量組和中劑量組效果最佳，最接近正常對照組，見表3。

表3 各組大鼠血漿中單胺類神經遞質含量比較（xˉ±s） ng/g

4 討 論

GPD 是臨床治療慢性失眠重要而有效的方劑，王燕等［3］以GPD 加減治療失眠患者32 例，總有效率為93.75%，證實本方能夠有效改善睡眠質量?，F代研究表明：GPD 能明顯延長戊巴比妥鈉所致小鼠的睡眠時間，具有鎮靜催眠作用，能提高動物腦內單胺類神經遞質5-羥色胺、多巴胺等含量，但其治療慢性失眠的作用機理尚不明確［4］。

本實驗采用改良水平臺復制大鼠慢性睡眠剝奪模型，觀察不同劑量GPD 治療慢性失眠可能的作用機制。本實驗結果表明：慢性睡眠剝奪大鼠晝夜節律紊亂，精神倦怠，皮膚色澤暗淡，毛發枯燥，喜靜少動，飲食減少，體質量降低，提示模型制備成功。經GPD 治療后，大鼠的一般狀態明顯改善，提示GPD 具有促眠作用。

CRH、ACTH 和CORT 是HPA 軸重要的組成激素，與睡眠密切相關。當機體長期處于應激狀態（如慢性睡眠剝奪）的情況下，會啟動激素級聯反應，使HPA 軸亢進，損傷腦組織［5］。臨床研究表明：在慢性失眠患者中，睡眠時間少于5 h 的患者，CORT 水平增加，總睡眠時間與CORT 成反比［6］。最新研究認為HPA 軸對睡眠的影響主要取決于CRH，激活HPA 軸能使ACTH 和CORT 的濃度增加，產生覺醒效應［7］。本實驗結果表明模型組大鼠血清和下丘腦中CRH、ACTH 和CORT 含量均顯著升高，提示大鼠經慢性睡眠剝奪后，HPA 軸功能亢進。經GPD治療后，血清和下丘腦中CRH、ACTH 和CORT 含量顯著降低，可推測GPD 可通過降低CRH、ACTH 和CORT 含量，負反饋調節HPA 軸而促睡眠，且以中劑量GPD 效果較優。

此外，HPA 軸還受到多種神經遞質的調控，如5-HT、NE、DA 等。5-HT 能神經元可以直接支配下丘腦室旁核分泌CRH，CRH 的釋放又受到5-HT受體的調控，影響HPA 軸功能；同時CRH、ACTH 和CORT 又能抑制5-HT 能神經元細胞的活性，二者之間存在復雜的相互作用［8］。MENON 等［9］使用微透析技術證明單胺遞質及其代謝產物在不同時長的睡眠剝奪期間發揮著重要作用。本實驗通過HPLC 法檢測5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，結果表明模型組5-HT 和5-HIAA 明顯下降，NE 和DA明顯升高。GPD 治療后能明顯升高5-HT 和5-HIAA 含量，降低NE 和DA 含量，提示GPD 能通過升高5-HT、5-HIAA 含量，降低NE、DA 含量而治療失眠，且以中劑量GPD 效果最佳。

綜上，GPD 能改善慢性睡眠剝奪大鼠一般狀態，調節5-HT、5-HIAA、NE 和DA 含量，降低CRH、ACTH 和CORT 含量，負反饋調節HPA 軸，改善HPA軸功能亢進狀態，從而治療慢性失眠。然而，本實驗因時間、技術有限，未對慢性睡眠剝奪大鼠的睡眠時相、腦電波特征進行監測，這值得今后深入研究，為GPD 的臨床使用提供科學依據。