基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討補(bǔ)腎健脾方治療卵巢早衰的機(jī)制

朱景茹，黃睿婷，林澤豪，王 洋

（福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)證基地，福建 福州 350122）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）好發(fā)于40 歲之前的育齡期女性，是以高卵泡刺激素和低雌激素水平為主要特征的卵巢功能衰退性婦科疾病［1］。據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，POF 在一般人群中的發(fā)病率為1%～3%，在原發(fā)閉經(jīng)的患者中發(fā)病率高達(dá)10%～28%，在繼發(fā)閉經(jīng)的患者中發(fā)病率達(dá)4%～18%［2］，是導(dǎo)致女性不孕的重要原因之一。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)以周期性激素療法為常用治法，但長(zhǎng)時(shí)間激素治療容易誘發(fā)不良反應(yīng)，增加POF 患者發(fā)生乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險(xiǎn)［3］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為卵巢中蘊(yùn)含生殖之“精”，依時(shí)排泄以供生殖之需，泄出真元后，卵巢表面形成黃體以維持子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)，使之易于容受胚胎著床［4］。有研究認(rèn)為補(bǔ)腎健脾類中藥對(duì)POF 患者各級(jí)卵泡的生長(zhǎng)均有促進(jìn)作用，能夠改善卵巢發(fā)育狀態(tài)，促進(jìn)卵泡顆粒細(xì)胞的增殖［5-6］。中藥復(fù)方成分的藥效學(xué)及其作用機(jī)制的研究是中藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)為中藥化合物作用機(jī)理的研究提供新的理論方法和研究思路［7］。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探討補(bǔ)腎健脾方與POF 作用靶點(diǎn)之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系，為補(bǔ)腎健脾方治療POF 的作用機(jī)制提供一定依據(jù)。

1 方 法

1.1 補(bǔ)腎健脾方活性成分篩選 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)系統(tǒng)與數(shù)據(jù)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］檢索補(bǔ)腎健脾方中熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、茯苓、人參、白術(shù)、甘草的所有活性成分，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 為篩選條件進(jìn)行藥物靶點(diǎn)過(guò)濾、獲取。

1.2 POF 治療靶點(diǎn)的獲取 以“premature ovarian failure”作為檢索詞在GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.genecards.org/）［9］檢索相關(guān)疾病靶點(diǎn)，以相關(guān)性得分≥20 進(jìn)行提取。通過(guò)Uniport 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org）進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，通過(guò)InteractiVenn網(wǎng)站（http：//www.interactivenn.net/）獲得韋恩圖，將POF 治療靶點(diǎn)與補(bǔ)腎健脾方的作用靶點(diǎn)進(jìn)行映射，獲取補(bǔ)腎健脾方治療POF 的共同靶點(diǎn)，繪制補(bǔ)腎健脾方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3 共同作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)（PPI 網(wǎng)絡(luò)）構(gòu)建與分析 將共同靶點(diǎn)輸至String 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//stringdb.org/）“multiple proteins”檢索框中，物種設(shè)置為“homo sapiens”，輸出初始PPI tsv 文件，再使用Cytoscape 3.8.0 軟件構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，以最低交互分?jǐn)?shù)≥0.90 為標(biāo)準(zhǔn)篩選出排名前20 名的核心靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG富集分析 將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行分析，在R 語(yǔ)言中安裝“DOSE”“colorspace”“stringi”“pathview”“clusterProfiler”插件，以P＜0.05 為閾值進(jìn)行GO 和KEGG富集分析，篩選出前20 名的生物學(xué)過(guò)程與信號(hào)通路。

1.5 分子對(duì)接 利用PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）得到補(bǔ)腎健脾方活性成分的結(jié)構(gòu)信息，在PDB 數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索核心靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)，最后利用Vina1.1.2 軟件完成補(bǔ)腎健脾方活性成分與前5 位核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接。

2 結(jié) 果

2.1 補(bǔ)腎健脾方活性成分信息 共篩選出補(bǔ)腎健脾方活性成分159 個(gè)，列出單味中藥OB 值排名前2位的活性成分信息，見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)腎健脾方活性成分信息

2.2 補(bǔ)腎健脾方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò) 共篩選出補(bǔ)腎健脾方作用靶點(diǎn)235 個(gè)，將其與347 個(gè)POF 治療靶點(diǎn)取交集得到62 個(gè)共同靶點(diǎn)，從而獲得補(bǔ)腎健脾方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)腎健脾方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果 PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有62 個(gè)節(jié)點(diǎn)，435 條邊，見(jiàn)圖2。根據(jù)Degree 值對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行排序，結(jié)果中僅列出排名前20 名的核心靶點(diǎn)，分別為絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、胱天蛋白酶3（CASP3）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（EGF）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）、原癌基因（MYC）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）、雌激素受體1（ESR1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK1）、環(huán)加氧酶2（PTGS2）、低聚果糖（FOS）、酪氨酸激酶受體2（ERBB2）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）、趨化因子2（CCL2）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、絲氨酸蛋白酶抑制劑1（SERPINE1）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（MTOR）。見(jiàn)圖3。

圖2 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 排名前20 的核心靶點(diǎn)圖

2.4 GO 和KEGG 富集分析 共獲取GO 條目87個(gè)，結(jié)果表明補(bǔ)腎健脾方治療POF 的前20 個(gè)生物學(xué)過(guò)程主要富集于DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性、配體激活轉(zhuǎn)錄因子活性、類固醇激素受體、泛素蛋白連接酶結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合等，見(jiàn)圖4。KEGG 富集分析篩選到129 條信號(hào)通路（P＜0.05），前20 條信號(hào)通路主要涉及到癌癥中蛋白多糖相關(guān)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)通路、HIF-1 信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路、AGERAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、IL-17 信 號(hào) 通 路等。見(jiàn)表2。

表2 KEGG 富集分析信號(hào)通路

2.5 分子對(duì)接結(jié)果 為了進(jìn)一步驗(yàn)證補(bǔ)腎健脾方活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的預(yù)測(cè)結(jié)果，將2.3 中排名前5 位的核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF與其對(duì)應(yīng)的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，獲得活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接自由能，見(jiàn)表3。自由能＜0 kcal/mol 說(shuō)明配體與受體可以自發(fā)結(jié)合，一般認(rèn)為兩者結(jié)合自由能越低，發(fā)生作用的可能性越大。補(bǔ)腎健脾方活性成分與核心靶點(diǎn)結(jié)合自由能均＜-5 kcal/mol，提示篩選出的核心靶點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的活性成分具有良好的親和力。其中，薯蕷皂苷元與AKT1、VEGFA、CASP3、IL-6、EGF 結(jié)合自由能最低，親和力最高，分子對(duì)接模式見(jiàn)圖5。

圖5 薯蕷皂苷元分子對(duì)接模式圖

表3 活性成分與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接自由能

3 討 論

卵巢早衰歸屬中醫(yī)學(xué)中“經(jīng)水早斷”“不孕”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎精盈滿，天癸成熟，寓示著女性生殖活動(dòng)的開始。若腎精衰減，天癸耗竭，月經(jīng)遲閉，則意味著卵巢生殖功能的終結(jié)［10］。腎中先天之精與脾胃后天之精皆為卵巢卵泡發(fā)育過(guò)程中關(guān)鍵的物質(zhì)基礎(chǔ)，是女性生殖與發(fā)育的根本。若脾腎虧虛，沖任失調(diào)，天癸耗竭，則卵巢卵泡無(wú)以為養(yǎng)，經(jīng)水漸斷。補(bǔ)腎健脾方是左歸飲（《景岳全書》）與四君子湯（《太平惠民和劑局方》）的合方，由熟地黃、山茱萸、枸杞子、山藥、人參、茯苓、白術(shù)、甘草8 味藥組成，具有補(bǔ)腎健脾、益氣滋陰的功效。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析補(bǔ)腎健脾方活性成分的復(fù)雜性和人體潛在調(diào)控靶點(diǎn)的多樣性，結(jié)果顯示：補(bǔ)腎健脾方的主要活性成分有薯蕷皂甙元、β-谷甾醇、槲皮素、柚皮素、山柰酚等。張永忠等［11］研究表明：薯蕷皂苷元能抑制A547 細(xì)胞的生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，還有抗炎、抑菌、平喘、降血脂等作用；β-谷甾醇具有廣泛的藥理活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗氧化、抑制腫瘤等［12］；槲皮素是黃酮類化合物，可以發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗菌等作用，有效促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和各級(jí)卵泡發(fā)育，增加雌激素分泌，從而改善POF 大鼠的卵巢功能［13-14］；柚皮素是從蕓香科植物柚中提取的一種單體成分，屬于黃酮類化合物，具有較強(qiáng)的清除自由基、抗氧化、抗炎作用［15］；山柰酚具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、心臟保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、抗糖尿病、抗骨質(zhì)疏松、抗雌激素、抗焦慮、鎮(zhèn)痛和抗過(guò)敏等活性［16］。

選取前5 個(gè)核心靶點(diǎn)AKT1、VEGFA、CASP3、IL6、EGF 與活性成分山柰酚、柚皮素、槲皮素、薯蕷皂苷元和β-谷甾醇進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果顯示核心靶點(diǎn)與活性成分結(jié)合活性良好，以薯蕷皂苷元與各蛋白的分子對(duì)接結(jié)果最好。本研究GO 富集分析結(jié)果顯示：補(bǔ)腎健脾方作用于POF 的機(jī)制涉及多個(gè)生物過(guò)程與分子功能，其中相關(guān)性最高的生物學(xué)過(guò)程涉及DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特異性、磷酸酶結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合、核受體活性等。KEGG 富集分析結(jié)果顯示：補(bǔ)腎健脾方治療POF 的作用機(jī)制與癌癥中蛋白多糖相關(guān)通路、人類巨細(xì)胞病毒感染相關(guān)通路、HIF-1 信號(hào)通路、內(nèi)分泌抵抗相關(guān)通路、AGE-RAGE 信號(hào)通路、TNF 信號(hào)通路、IL-17 等密切相關(guān)。可以看出，POF 的發(fā)生可能與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，與巨細(xì)胞病毒感染、缺氧炎癥反應(yīng)也可能密切相關(guān)。缺氧是能量代謝、細(xì)胞增殖和死亡過(guò)程中發(fā)生的一種生理應(yīng)激，在卵泡發(fā)育過(guò)程中，由于基底屏障阻隔了血管向卵泡內(nèi)部的滲透，卵泡內(nèi)形成局部低氧環(huán)境［17］，HIF-1 信號(hào)通路是生物處于低氧狀態(tài)下的應(yīng)激信號(hào)通路，可通過(guò)調(diào)節(jié)HIF-1α 功能來(lái)保護(hù)卵巢功能。TNF-α 與POF 發(fā)生有關(guān)，炎癥和相關(guān)的氧化應(yīng)激反應(yīng)還能通過(guò)過(guò)早激活原始卵泡使之耗竭，影響正常生殖年齡女性的生育能力［18］。IL-17 水平升高可直接或間接誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子、趨化因子、炎癥因子和抗微生物蛋白識(shí)別介導(dǎo)自身免疫和慢性炎癥反應(yīng)［19］，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)可促進(jìn)卵巢功能衰竭，從而參與POF 的發(fā)生。

綜上所述，我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步預(yù)測(cè)了補(bǔ)腎健脾方治療POF 的作用機(jī)制，其可能是通過(guò)槲皮素、β-谷甾醇等主要活性成分起到抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)的作用，降低炎性因子IL-17 水平來(lái)減輕POF 卵巢細(xì)胞的缺氧狀態(tài)，調(diào)節(jié)HIF-1α 等細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和蛋白的表達(dá)，或通過(guò)調(diào)控TNF 等信號(hào)通路，從而改善卵泡的發(fā)育狀態(tài)，起到治療POF的作用，具有一定的研究?jī)r(jià)值。為進(jìn)一步驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果的可靠性，后期有必要開展相應(yīng)的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡釋補(bǔ)腎健脾方治療POF 的作用機(jī)制。