大承氣湯對急性肺損傷大鼠的治療效果評估

王浴鑫 翟翠娟

【摘要】 目的：評估地塞米松、抗生素、中藥大承氣湯對急性肺損傷大鼠的治療效果。方法：盲腸結扎穿刺術建立膿毒癥急性肺損傷大鼠模型，設置地塞米松、抗生素以及中藥治療組。通過比較大鼠一般狀況、24 h死亡率、肺系數、肺組織病理改變、炎癥因子水平等評價藥物治療效果。結果：各藥物治療組大鼠術后均出現氣促、口鼻紅色血痂、懶動等不良表現，但與模型組相比情況有好轉。地塞米松治療組、抗生素治療組以及中藥治療組24 h大鼠死亡率分別為8.33%、16.67%、33.33%，較模型組死亡率（41.67%）降低。模型組肺系數（5.016±0.961），高于假手術組（3.979±0.377），差異有統計學意義（P<0.05）。地塞米松治療組、抗生素治療組、中藥治療組肺系數分別為（4.376±0.295）、（4.214±0.574）、（4.438±0.313），均低于模型組，但差異均無統計學意義（P>0.05）。病理切片提示三組藥物干預組均有炎性細胞浸潤、肺泡破裂和毛細血管充血等肺損傷表現，但與模型組相比有明顯改善。術后24 h，與模型組相比，藥物治療組血清促炎因子TNF-α和IL-6均降低，抗炎因子IL-10圴升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：地塞米松、抗生素、DCQD對急性肺損傷大鼠的治療均有效，能夠改善其一般狀況，降低死亡率，減輕炎癥反應，對于指導臨床急性肺損傷藥物治療有一定意義。

【關鍵詞】 急性肺損傷 膿毒癥 大承氣湯 抗生素 地塞米松 炎癥因子

[Abstract] Objective： To evaluate the therapeutic effects of Dexamethasone， antibiotics and Dachengqi Decoction on acute lung injury rats. Method： The rat model of septic acute lung injury was established by caecal ligation and puncture， and Dexamethasone， antibiotics and traditional Chinese medicine treatment groups were set up. The effect of drug treatment was evaluated by comparing the rats’ general condition， 24 h mortality， lung coefficient， lung tissue pathological changes and inflammatory factors. Result： The rats in each drug treatment group had bad manifestations such as shortness of breath， red blood scab of mouth and nose and lazy movement， but the situation were better than that in the model group. The 24 h mortality of Dexamethasone treatment group， antibiotic treatment group and traditional Chinese medicine treatment group were 8.33%， 16.67% and 33.33% respectively， which was lower than 41.67% of model group. The lung coefficient in the model group （5.016±0.961） was higher than that in the sham operation group （3.979±0.377）， the difference was statistically significant （P<0.05）. The lung coefficients of Dexamethasone treatment group， antibiotic treatment group and traditional Chinese medicine treatment group were （4.376±0.295）， （4.214±0.574） and （4.438±0.313） respectively， which were lower than those of model group， but the differences were not statistically significant （P>0.05）. Pathological sections showed that the three drug intervention groups had lung injury manifestations such as inflammatory cell infiltration， alveolar rupture and capillary congestion， but it was significantly improved compared with the model group. 24 h after operation， compared with the model group， the serum pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-6 decreased in the drug treatment group， while the anti-inflammatory cytokines IL-10 increased， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Dexamethasone， antibiotics and Dachengqi Decoction are effective in the treatment of acute lung injury rats， which can improve their general condition， reduce mortality and reduce inflammatory reaction， it has certain significance for guiding the drug treatment of acute lung injury.

[Key words] Acute lung injury Sepsis Dachengqi Decoction Antibiotics Dexamethasone Inflammatory cytokines

First-author’s address： Jing’an District Central Hospital， Shanghai 200040， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.03.007

引起急性肺損傷的一個重要原因是膿毒癥患者的腸屏障功能受損，腸道中的大量細菌和內毒素通過門靜脈和淋巴系統侵入血液循環，引起膿毒癥，最終引起多器官功能障礙。肺損傷往往發生早，發展快，是膿毒癥患者最直接的死亡原因之一。目前尚無有效的藥物治療方法，主要是針對病因治療和呼吸循環支持治療。大承氣湯對急性肺損傷的炎癥細胞和細胞因子具有免疫調節作用，可從多水平、多靶點發揮治療作用，對于治療急性肺損傷具有廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 動物和藥物準備 研究時間為2020年2-12月，選取健康雄性SPF級SD大鼠60只，體重180～280 g，由上海必凱公司提供。ELISA試劑盒購自上海勵韜生物科技有限公司（R&D，芬蘭）。注射用頭孢他啶[生產廠家：國藥集團致君（深圳）制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20013299，規格：1.0 g/支]，注射用地塞米松磷酸鈉（生產廠家：馬鞍山豐原制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20051748，規格：5 mg/支）。大承氣湯：經典煎制法，取大黃24 g，厚樸30 g，枳實24 g，芒硝18 g。先將厚樸枳實煮沸15 min，再加大黃煮沸5 min，最后下芒硝，待完全溶解后濾液去渣，制成100%（W/V）的水煎液，4 ℃保存備用。

1.2 模型制備和分組 60只實驗大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、地塞米松治療組、抗生素治療組、中藥（大承氣湯）治療組，每組12只。急性肺損傷模型制備：大鼠腹腔找到盲腸并結扎盲腸總長度的75%，周徑的2/3（避免結扎過緊導致盲腸缺血壞死），使用直徑3 mm的穿刺針在結扎部分中段穿刺出一個孔并擠出少許糞便保證穿刺成功（假手術組不進行穿刺結扎步驟）。三組藥物治療組均在急性肺損傷模型基礎上給予藥物干預。地塞米松治療組：術后即給予腹腔注射地塞米松，濃度為0.25 mg/mL，根據大鼠體重給藥量為5 mg/kg，給藥頻次為1次/d。抗生素治療組：術后即給予腹腔注射頭孢他啶，濃度為20 mg/mL，注射劑量為180 mg/kg。術后6 h同等劑量再注射1次，2次/d給藥。中藥治療組：術前1 h經口灌胃大承氣湯，濃度100%，給藥劑量1 mL/100 g，術后6 h同等劑量再灌胃1次，2次/d。

1.3 肺系數 術后24 h，心臟取血處死后取左全肺，用干凈紗布吸掉肺表面血液。電子秤稱重（濕重），放置于干燥箱60 ℃干燥3 d至恒重，稱重（干重）。肺系數=肺濕重/干重。

1.4 肺病理制作 取新鮮肺組織（右上肺），依次進行脫水、包埋、切片、石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染細胞核、伊紅染細胞質、脫水封片、顯微鏡鏡檢、圖像采集分析。

1.5 炎癥因子測定 術后24 h取麻醉大鼠心臟新鮮血液，離心后取上清液即為血清，并于-80 ℃條件保存。采用雙抗體夾心ABC-ELISA法。用抗大鼠TNF-α單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的TNF-α與單抗結合，加入生物素化的抗大鼠TNF-α，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的Streptavidin與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測OD值，TNF-α水平與OD值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中TNF-α水平。同樣方法測定IL-6、IL-10水平。

1.6 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件、GraphPad.Prism.5.醫學繪圖軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，多組數據比較采用方差分析，兩組數據比較使用LSD檢驗;計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般狀況 模型組一般狀況最差，精神極度萎靡，進食、活動明顯減少，氣促，寒戰，毛發豎立雜亂，黃色黏液稀便，口鼻分泌粉紅色泡沫，術后24 h內死亡率最高。假手術組術后正常活動，無任何不良癥狀。各藥物治療組均出現氣促、口鼻紅色血痂、懶動等不良表現，但情況好于模型組，死亡率也有降低。

2.2 各組大鼠24 h死亡率比較 每組大鼠總數均為12只，其中假手術組無大鼠死亡，模型組24 h死亡率最高，為41.67%（5/12），地塞米松治療組死亡率最低，為8.33%（1/12），抗生素治療組為16.67%（2/12），中藥治療組為33.33%（4/12）。藥物治療組死亡率和模型組比較均降低，可見三種藥物均可以改善急性肺損傷大鼠死亡率。

2.3 肺組織病理變化 假手術組無肺泡病理損傷表現，見圖1。模型組病理表現為支氣管壁炎性細胞浸潤，肺泡腔內有粉紅色蛋白黏液滲出，部分肺泡腔代償性擴張，部分肺泡萎縮、坍塌，肺泡隔增生伴有炎性細胞浸潤，見圖2。三組藥物治療組均有不同程度的肺組織炎性損傷表現，但較模型組病理損傷程度減輕，見圖3、4、5。

2.4 各組大鼠肺系數比較 各組剔除死亡大鼠后取7只進行研究，模型組肺系數（5.016±0.961），高于假手術組（3.979±0.377），差異有統計學意義（t=-2.842，P=0.013）。地塞米松治療組、抗生素治療組、中藥治療組肺系數分別為（4.376±0.295）、（4.214±0.574）、（4.438±0.313），均低于模型組，差異均無統計學意義（t=-1.802、-2.029、-1.619，P=0.093、0.062、0.128）。見圖6。

2.5 血清炎癥因子變化

2.5.1 各組大鼠血清IL-6水平比較 術后24 h，地塞米松治療組血清IL-6水平為（5.518±0.849）pg/mL，抗生素治療組（2.293±0.485）pg/mL，中藥治療組（3.928±0.306）pg/mL，模型組（8.872±2.232）pg/mL，假手術組（0.974±0.233）pg/mL。各組大鼠術后24 h的血清IL-6水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。術后24 h，模型組較假手術組IL-6水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）;術后24 h，三個藥物治療組較模型組IL-6水平均降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖7。

2.5.2 各組大鼠術后24 h血清TNF-α水平比較 術后24 h，地塞米松治療組血清TNF-α水平為（9.745±1.193）pg/mL，抗生素治療組（4.403±0.842）pg/mL，中藥治療組（6.208±0.512）pg/mL，模型組（16.028±3.941）pg/mL，假手術組（1.661±0.813）pg/mL。各組大鼠術后24 h的血清TNF-α水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。術后24 h，模型組較假手術組TNF-α水平明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。術后24 h，三個藥物治療組較模型組TNF-α水平均降低，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖8。

2.5.3 各組大鼠術后24 h血清IL-10水平比較 術后24 h，地塞米松治療組IL-10水平為（40.752±0.423）pg/mL，抗生素治療組（47.513±3.062）pg/mL，中藥治療組（44.043±0.856）pg/mL，模型組（38.215±1.087）pg/mL，假手術組（42.368±0.576）pg/mL。各組大鼠術后24 h的血清IL-10水平比較，差異有統計學意義（P<0.05）。術后24 h，模型組IL-10水平較假手術組低，差異有統計學意義（P<0.05）。術后24 h，三個藥物治療組IL-10水平較模型組均升高，差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖9。

3 討論

急性肺損傷可由直接（肺部）原因引起，如肺炎、誤吸、溺水、吸入有毒氣體等，或間接（肺外）原因引起，如嚴重的全身損傷，如敗血癥、休克或胰腺炎[1-2]。目前，急性肺損傷還沒有特異性治療方法，針對原發病治療、肺保護性低潮氣量通氣和液體管理仍然是急性肺損傷的主要治療策略[3]。由于疾病的復雜性（即其涉及多種信號通路），用抗體阻斷單個促炎細胞因子或使用抗氧化劑都沒有益處。目前在研發減輕損傷和炎癥的特異性療法方面進展甚微。

無論急性肺損傷病因如何，患者都容易并發繼發性肺部感染，即呼吸機相關性肺炎（VAP）。從肺部獲取樣本進行微生物培養對于確定感染至關重要。急性肺損傷患者插管后常出現氣道定植菌，這種定植會使感染的識別變得困難，所以區分定植菌很重要[4]。針對病原學培養檢測到的致病菌選擇恰當的抗生素對一些患者非常重要，但有菌群失調和其他不良風險[5]。由于現有技術不完善，急性肺損傷肺部感染的診斷存在治療不足和治療過度的風險。臨床特征、血液學檢查和放射學評估相結合，結合肺部微生物取樣，仍然是當前的金標準。未來宏基因組測序將對病原體進行更早更精確診斷和更有針對性的治療[6]。即使無明顯感染表現，機械通氣患者肺部生物多樣性減少，腸型微生物增多[7]。VAP最常見的致病細菌包括腸桿菌、綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌和不動桿菌[8]。院內感染可加重急性肺損傷患者低氧血癥和死亡率，因此必須加強對這些感染的預防，以避免影響患者預后。未來可發展非抗生素療法，包括疫苗、單克隆抗體和噬菌體療法。

幾十年來，研究者們對治療急性肺損傷的激素給藥進行了深入的討論。因為患者選擇、激素治療方法（起始時間、藥物選擇、劑量、治療持續時間）和數據處理的差異，臨床試驗數據常相互矛盾[9]。因此，到目前為止，還沒有關于急性肺損傷激素使用的明確結論。糖皮質激素通常被認為是免疫抑制藥物，但研究表明糖皮質激素可抑制炎癥反應后免疫重組[10]，從而改善患者對肺炎、急性肺損傷等呼吸系統并發癥的易感性和預后[11]。在急性呼吸窘迫綜合征的早期給予激素似乎更有效。Meduri等[12]從2007年開始在嚴重急性肺損傷患者早期使用低劑量甲基強的松龍，顯示機械通氣和住院時間均顯著減少，死亡率降低，感染并發癥發生率降低。最近的研究顯示了糖皮質激素的優勢，延長激素使用時間可縮短機械通氣和住院時間、改善氧合[13]，可能是因為其具有抗炎、抗氧化和減輕肺水腫的作用。需要多中心研究確定最合適的激素劑量、時機和選擇，并分析其潛在風險[14]。

臨床使用的治療急性肺損傷的藥物有幾個缺點，包括副作用和治療費用高。近年來自幾種天然藥物在實驗模型中的研究，已顯示出在分子水平上可抑制急性肺損傷相關的多種炎癥通路。這些藥物具有多重效應，如抑制促炎通路，激活抗氧化防御機制[15]。天然藥物的生物學效應可能有助于開發急性肺損傷的新療法。這些天然藥物的優勢是它們已經在亞洲大陸應用了幾個世紀，且沒有明顯的毒性。在細胞培養和動物模型中研究了這些化合物緩解肺部炎癥的潛力，幾項研究集中在能夠抑制TLR信號通路，特別是抑制核因子-κB。然而，為了開發治療方法，必須在人體試驗中進行系統研究（包括藥代動力學和藥效學）。

《傷寒雜病論》記載了2000年前漢代張仲景所創立的大承氣湯。它由大黃、厚樸、枳實、芒硝組成，起初用于治療便秘。大承氣湯用于傳統醫學已有數千年歷史，被證明具有廣泛的藥理活性[16]。許多研究證實大承氣湯對炎癥因子有顯著的抑制作用，包括抑制MAPK、NF-κB等，對許多急性炎癥性疾病有顯著作用[17]。Hu等[18]證明了大承氣湯不僅能減輕炎癥細胞因子的釋放，減輕這些炎癥因子對器官和組織損傷的影響，而且還能調節毛細血管的通透性。Sun等[19]研究揭示了大承氣湯17種活性成分通過調節PI3K/AKT信號通路，促進細胞凋亡，抑制病理損傷和炎癥而改善急性胰腺炎。根據共有信號通路篩選中藥單體，構建蛋白質相互作用網絡和轉錄因子預測網絡，這反映了中藥化合物的多靶點作用。

為驗證大承氣湯對急性肺損傷的療效和炎癥調控作用，本試驗通過急性肺損傷大鼠給藥后一般狀況、24 h死亡率、肺系數、肺組織病理改變、炎癥因子水平的對比，結果顯示抗生素、激素、中藥三種臨床較常用的藥物對于治療急性肺損傷均有效。急性肺損傷大鼠在使用藥物治療后，寒戰、氣急、反應差等表現改善，提示藥物可減輕全身炎癥反應，同時口鼻粉紅色泡沫滲出減少也反映出可改善肺水腫。肺系數一定程度可反映損傷肺滲出程度和肺損傷的嚴重程度，三組治療藥物肺系數雖然有降低，但與模型組比較均無統計學差異。急性肺損傷大鼠24 h死亡率高達41.67%，說明了疾病嚴重程度、進展快、高死亡率、預后差特點，疾病早期給予地塞米松的大鼠短期死亡率降低最明顯，也許與激素強大的抗炎和減輕肺水腫作用有關[20]。急性肺損傷大鼠24 h血清炎癥因子已出現明顯異常和失衡，表現為促炎強化和抗炎減弱[21]。三組藥物治療組中，促炎因子IL-6、TNF-α血清水平均在抗生素治療組最低，地塞米松治療組最高;而抗炎因子IL-10水平抗生素治療組最高，地塞米松治療組最低。本試驗中抗生素治療組促炎因子下調和抗炎因子上調最明顯，反映了抗生素調控炎癥失衡的優勢，中藥治療組居中，而地塞米松治療組改善炎癥失控最弱。試驗提示糾正過度的炎癥反應和減輕肺泡毛細血管通透性可能是預防和治療急性肺損傷的有效治療。臨床患者的個體差異及疾病狀態，包括動態評估感染情況、肺滲出程度、炎癥失控進程、腸道屏障等臟器受損程度，是筆者慎重選擇藥物治療前必須思考的。

將傳統中醫療法和現代醫學療法相結合，可以獲得更全面的療效和實質性好處，例如可控制的疾病進展、降低死亡率和提高治療效果。然而，大承氣湯治療急性肺損傷的保護作用和潛在機制尚未見報道。未來的挑戰在于證明這些化合物在臨床試驗中的有效性和安全性的轉化研究，需要明確其在急性肺損傷的藥代動力學和藥效學[22]。急性肺損傷患者使用這些藥物的轉化研究將為開發這種高死亡率疾病急需的新療法提供潛在的機會。

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（收稿日期：2021-12-17） （本文編輯：姬思雨）