不同檢測方法對鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的鑒定結果比較及同源性分析*

趙智龍，姚汶藝，宮海燕，史 松

新疆醫科大學第五附屬醫院：1.檢驗科；2.營養科；3.醫務部，新疆烏魯木齊 830011

對臨床分離的病原菌進行精確、快速的鑒定是抗感染治療的主要途徑，針對病原菌科學使用抗菌藥物，可有效控制耐藥菌的產生與傳播，降低醫療成本與病死率。隨著抗菌藥物的廣泛使用及病原菌的變異，傳統的細菌生化鑒定法已經無法滿足臨床耐藥菌診治的發展需求。熒光雜交和聚合酶鏈式反應鑒定方法較為準確，但成本昂貴且費時，不適用于臨床標本的常規鑒定[1- 2]。近年來，基質輔助激光解析/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)通過樣品制備、蛋白提取、圖譜分析和統計學評價等步驟，可以實現對細菌屬、種、亞種乃至株水平上的準確快速鑒定[3]。MALDI-TOF MS已被廣泛應用于臨床病原菌的快速鑒定，該方法快速、高效，可為臨床治療提供有效的幫助[4]。由于細菌在不同地域存在一定差異，對本地菌株進行不同方法學的鑒定比較，可有效提高臨床病原菌的鑒定水平。因此，本研究比較MALDI-TOF MS與細菌生化鑒定兩種方法對臨床常見病原菌鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的鑒定差異，并進行同源性分析，旨在為臨床抗感染治療提供依據。

1 材料與方法

1.1菌株來源 新疆醫科大學第五附屬醫院2019年3-4月從臨床標本分離出的40株鮑曼不動桿菌敏感菌株、40株大腸埃希菌敏感菌株。

1.2儀器與試劑 MALDI-TOF MS所用甲酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：151817)、乙腈(美國賽默飛世爾科技公司，批號：167900)、α-氰-4-羥基肉桂酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：SHBD0586V)、三氟乙酸(美國賽默飛世爾科技公司，批號：153080)、無水乙醇(美國賽默飛世爾科技公司，批號：159116)均為色譜純，購自Fisher Chemical。培養基為含5%～10%羊血的營養瓊脂(中國北京陸橋技術有限公司)，標準菌株為大腸埃希菌ATCC8739。質譜儀Clin-TOF Ⅱ型基質輔助激光解析/飛行時間質譜(中國北京毅新博創生物科技有限公司)，VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(法國生物梅里埃公司)。數據采集軟件為Shimadzo Biotech MALDI-MS 2.9.3(中國北京毅新博創生物科技有限公司)，微生物鑒定軟件及聚類分析軟件均為MicroID version 4.0(中國北京鑫匯普瑞公司)，測序反應試劑盒為Big-dye試劑盒(美國ABI公司)，Taq酶采用TaqHotStart DNA Polymerase(日本Takara公司)，擴增儀為Verity PCR儀擴(美國ABI公司)，測序采用3730XL測序儀(美國ABI公司)。

1.316S rRNA測序 引物序列根據基因序列信息，采用的Primer5.0軟件由北京博云輝科技有限公司設計并合成，F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，R：GGTTACCTTGTTACGACTT；采用Big-dye試劑盒的25 μL反應體系,預變性95 ℃ 300 s，擴增35個循環，循環參數:95 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 60 s，然后72 ℃ 300 s保溫。16S rRNA測序結果，采用NCBI網站數據進行比對鑒定，采用mega7.0進行同源性分析。

1.4MALDI-TOF MS鑒定 標準菌株和待檢菌株均提取蛋白后用于鑒定。用接種環取菌落約5 mg，置于盛有300 μL純水的1.5 mL離心管中，振蕩均勻。向離心管中加入900 μL無水乙醇，振蕩，用漩渦儀混勻3～5 s。混合后用離心機以12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，再次以12 000 r/min離心2 min，吸棄剩余液體，置于室溫干燥5 min。加入40 μL 70%甲酸，充分振蕩，漩渦儀混勻3～5 s，之后再加入40 μL乙腈，充分振蕩，漩渦儀混勻3～5 s，用離心機以12 000 r/min離心2 min后，用移液槍吸取1 μL上清液點到靶板上，待室溫干燥后加1 μL基質溶液覆蓋在樣品點上，室溫條件下自然晾干。標準菌株大腸埃希菌ATCC8739作為質量控制，將金屬靶板放入儀器中檢測。為確保細菌鑒定的準確性，最大化降低系統誤差和人工操作誤差，同一株菌由3名人員分別提取蛋白樣品檢測。鑒定時，同一株菌每名人員點靶24個位點，共72個位點。MALDI-TOF MS采集細菌肽質量譜，所用參數如下：激光頻率40 Hz，激光能量64%，選擇線性正離子模式。采集分子量為2 000～20 000的肽質量譜。每個標本的肽質量譜在不同位置經過500次激光點擊獲得。首先利用標準菌株的特征峰數據對設備進行分子量校準，然后再將待測菌株的數據與MicroID 4.0數據庫中的圖譜進行比對，然后給出相應的分值，并得出鑒定結果。蛋白質特征圖譜采用MicroID 4.0進行相似度比對；MALDI-TOF MS結果和VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀結果分別與16S rRNA進行比較：(1)一致即判定為鑒定正確；(2)不一致即判定為鑒定錯誤；(3)未鑒定出結果，即判定為失敗鑒定。

1.5細菌生化鑒定 采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀對標本進行細菌生化鑒定。

1.6統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1MALDI-TOF MS與細菌生化鑒定的結果比較

2.1.1細菌生化鑒定 采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀從臨床標本中分離出40株鮑曼不動桿菌待測菌、40株大腸埃希菌待測菌。

2.1.2鮑曼不動桿菌鑒定比較 將16S rRNA基因測序結果通過NCBI進行比對，結果顯示，通過細菌生化鑒定出的40株鮑曼不動桿菌待測菌中有19株鮑曼不動桿菌，21株非鮑曼不動桿菌；MALDI-TOF MS鑒定結果為鮑曼不動桿菌19株、皮特不動桿菌12株、醫院不動桿菌3株、抗輻射不動桿菌2株，4株未鑒定出。除4株未鑒定出的標本，MALDI-TOF MS對其余菌株的鑒定結果與16S rRNA基因測序結果一致性較好(90.00%)。細菌生化鑒定結果顯示，40株待測菌均為鮑曼不動桿菌，與16S rRNA基因測序的鑒定結果的一致性較差(47.50%)。

2.1.3大腸埃希菌鑒定比較 將16S rRNA基因測序結果通過NCBI進行比對，結果顯示，40株通過細菌生化鑒定出的大腸埃希菌待測菌均為大腸埃希菌；MALDI-TOF MS、細菌生化鑒定與16S rRNA基因測序的鑒定結果一致(100.00%)。

2.1.4基于鑒定結果的判別比較 對兩組儀器鑒定方法結果的準確性進行比較，對鮑曼不動桿菌的鑒定差異具有統計學意義(P<0.05)，對大腸埃希菌的鑒定差異無統計學意義(P>0.05)。MALDI-TOF MS有4株失敗鑒定結果，細菌生化鑒定無失敗鑒定結果，細菌生化鑒定有21株鑒定錯誤結果，均是對鮑曼不動桿菌復合菌無法進行辨別鑒定，見表1。

表1 MALDI-TOF MS與細菌生化鑒定的結果比較(n)

2.2鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌的MALDI-TOF MS譜圖與聚類分析 將通過16S rRNA基因測序篩選出的鮑曼不動桿菌(19株)、大腸埃希菌(40株)的譜圖，采用MALDI-TOF MS法采集特征峰譜圖，獲得的譜圖顯示，鮑曼不動桿菌都有m/z4244、m/z4257、m/z5746、m/z8485、m/z8510峰；大腸埃希菌都有m/z4364、m/z4497、m/z4613、m/z5095、m/z5116、m/z5339、m/z5402、m/z5611、m/z6275、m/z6410、m/z6507、m/z7158、m/z7870、m/z9065、m/z9742峰。

2.3同源性分析 采用MicroID 4.0對鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌的特征圖譜進行相似度比對，結果用樹狀圖表示(圖1、2)，其中橫坐標表示的百分比越小，圖譜同源性越差。從同源性樹狀圖可以看出，除了B5號菌株同源性較差外，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數同源性在70%以上，基本可以歸為同一菌種。采用mega7.0對篩選出的鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌的16S rRNA結果進行同源性分析。其中鮑曼不動桿菌同源性達96.36%(圖3)，大腸埃希菌同源性達到94.92%(圖4)。基于質譜的特征圖譜和分子生物學的同源性分析，可以看出兩種分析方式得出的同源性存在一定的差異。質譜的特征圖譜的相似度比對，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數同源性在70%以上。16S rRNA測序的基因序列比對所得的同源性分析，鮑曼不動桿菌和大腸埃希菌大多數同源性在95%以上。不同的方法學，對于同源性的百分比范圍有所差異，但在相應的范圍可評價菌種之間的同源性情況。

圖1 鮑曼不動桿菌質譜圖的聚類圖

圖2 大腸埃希菌質譜圖的聚類圖

圖3 鮑曼不動桿菌16S rRNA的同源性樹狀圖

圖4 大腸埃希菌16S rRNA的同源性樹狀圖

3 討 論

通過對鑒定結果的準確性進行比較，MALDI-TOF MS與細菌生化鑒定在對鮑曼不動桿菌的正確鑒定上存在一定的差異，MALDI-TOF MS的正確鑒定率高于細菌生化鑒定。16S rRNA基因測序與MALDI-TOF MS鑒定鮑曼不動桿菌的一致性為90.00%，與生化鑒定的一致性為47.50%；對于大腸埃希菌，16S rRNA基因測序與MALDI-TOF MS鑒定、生化鑒定的一致性均為100.00%。基于質譜的特征圖譜和分子生物學的同源性分析進行比較，同源性存在一定的差異，但在相應的范圍仍可評價菌種之間的同源性情況。總體來說，MALDI-TOF MS對鮑曼不動桿菌、大腸埃希菌鑒定結果的準確性較高，鑒定能力較強，對臨床感染的診斷具有一定的鑒定價值。

目前，建立在細菌形態學、細胞生理和生化基礎上的傳統鑒定方法是臨床微生物實驗室鑒定細菌的主要方法。傳統的生化鑒定有易操作、耗材便宜等特點，但也存在報告時間較長、結果的準確性依賴于操作人員的技術水平、無法及時準確地向臨床反饋結果等不足[5]。隨著核酸技術發展，序列測定被用于細菌精準鑒定，但仍有鑒定周期長、對實驗室及操作人員有著極高的要求等特點。而近年來質譜鑒定技術的興起，開啟了細菌鑒定的新時代，微生物工作者們開始從蛋白質水平對微生物進行鑒定。MALDI-TOF MS可以很好地彌補生化鑒定的不足，適合大批量標本的鑒定，快速報告結果，將傳統方法的報告時間從2～4 d縮短到幾個小時[6]。本研究將細菌生化鑒定和MALDI-TOF MS結果與更加精確的測序法進行對比，可以看出，MALDI-TOF MS的穩定性和一致性比傳統的細菌生化鑒定更好。對于傳統細菌生化鑒定無法區分的相似菌種，諸如鮑曼不動桿菌復合菌的鑒定，MALDI-TOF MS就可以很好地對其進行區分，其分辨率與16S rRNA基因測序基本一致。

受不同地區氣候、環境、經濟等因素的影響，質譜特征峰會有些許差別，由此會導致某些菌株鑒定失敗。通過建立本地區細菌菌株的特征圖譜，可以有效避免因地區差異造成的鑒定失敗，并及時準確地向臨床報告鑒定結果[7-8]。此外，為了實現最佳匹配，提高其分型鑒定能力，需要足量的病原菌構建本地區菌株數據庫。隨著對生物標簽的廣泛研究和圖庫數據庫的不斷完善，MALDI-TOF MS得到了廣泛的應用[9-10]。研究表明，在對多種細菌感染的鑒定中，需實行傳統技術、流程以避免漏檢，并應用聯合檢測方法進行相互補充，以優化流程和提升鑒定能力[11-12]。