先天性心臟病胎兒的染色體微陣列分析*

鐘艷娟，盧 建，吳佳佳，吳澤珊，陳劍虹

1.廣東省惠州市第一婦幼保健院產前診斷中心，廣東惠州 516001；2.廣東省婦幼保健院胎兒遺傳醫學中心，廣東廣州 510000

先天性心臟病(CHD)是胎兒時期心血管發育異常而形成的先天畸形，是導致新生兒及嬰幼兒死亡的主要原因之一。全世界每年大約有135萬例先天性心臟病患兒出生[1]，而我國新生兒先天性心臟病發病率為 7‰～8‰[2]，連續多年位居出生缺陷第一位。研究表明，產前超聲發現的CHD胎兒中，18%～22%合并染色體異?；蛑虏⌒匀旧w拷貝數變異(CNV)[3]。因此，避免合并染色體異常以及致病性CNV的CHD患兒出生，成為降低出生缺陷的一項重要舉措。目前，染色體核型分析仍是產前診斷的主要檢測方法，但是無法檢測到5 Mb以下染色體片段的重復和缺失。染色體微陣列分析(CMA)是近年發展起來的高分辨率分子技術，能在全基因組水平進行掃描，對于染色體微缺失、微重復等不平衡重排有明顯優勢。根據芯片設計與檢測原理的不同，CMA技術可分為兩大類：基于微陣列的比較基因組雜交(aCGH)技術和單核苷酸多態性微陣列(SNP array)技術。通過aCGH技術能夠很好地檢出CNV，而SNP array 技術除了能夠檢出CNV外，還能夠檢測出大多數的單親二倍體(UPD)和三倍體，并且可以檢測到一定水平的嵌合體。而設計涵蓋aCGH+SNP array檢測探針的芯片，可同時具有aCGH和SNP array芯片的特點[4-5]。2013年，美國婦產科學會(ACOG)及美國母胎醫學學會(SMFM)發表臨床指南，指出在產前超聲檢查顯示結構異常的胎兒中，推薦用CMA替代傳統的染色體核型分析技術[6]。本研究通過應用CMA，在全基因組水平分析CHD胎兒的遺傳學病因，探索CMA技術在CHD胎兒致病基因中的臨床應用價值?，F報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2018年5月至2020年5月于廣東省惠州市第一婦幼保健院超聲科經2位有產前診斷資質的超聲專家確診胎兒為CHD的病例，由經過專業培訓及具備相應資質的臨床遺傳醫師對孕婦及家屬進行遺傳咨詢，充分告知介入性產前診斷手術的感染風險、胎兒丟失率，詳細講解CMA技術以及染色體核型分析的優勢、局限性和可能的結果等，孕婦及其家屬自愿選擇進行產前診斷，并簽署手術知情同意書。納入研究的孕婦共216例，其中檢測羊水標本211例，臍血標本5例，均同時進行染色體核型分析及CMA，本研究經過醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2方法

1.2.1分組 在216例CHD胎兒中，根據結構畸形情況分成3組：單一心臟結構畸形組(Ⅰ組)、多發心臟結構畸形組(Ⅱ組)、心內合并心外結構畸形組(Ⅲ組)。Ⅰ組胎兒只有1處心血管畸形，Ⅱ組胎兒具有2處及以上心血管畸形，Ⅲ組胎兒心內合并心外結構異常，包括神經系統、泌尿系統、消化系統以及胎兒宮內生長受限(FGR)、羊水過多、羊水過少等。

1.2.2染色體核型分析 在無菌操作條件下，將抽取的羊水或臍血裝入無菌離心管內離心收集羊水或臍血細胞，采用貼壁細胞培養法培養，收獲、制片和G顯帶，全自動掃描儀掃描、拍照。依據人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2009)標準進行G顯帶染色體核型分析診斷。

1.2.3CMA檢測 收集的胎兒羊水或臍血標本及時送至廣東省婦幼保健院胎兒遺傳醫學中心進行檢測。該中心使用美國Afffymetrix公司生產的Cytoscan 750k芯片對全基因組已知基因區域進行掃描，數據分析參照DECIPHER、ISCA、OMIM、DGV、UCSC等數據庫資料。判斷所檢出CNV的性質，根據相應的標準分為：(1)致病性CNV；(2)臨床意義不明確的CNV(VOUS )；(3)良性CNV。

1.2.4CMA結果驗證 對CMA檢出為致病性CNV的胎兒標本，采用實時熒光定量PCR技術進行驗證，當檢測結果提示VOUS時，應進一步檢測胎兒父母的CNV，排除家族性良性變異，給予家屬客觀的遺傳咨詢意見。

1.3隨訪 對所有CHD胎兒病例進行電話隨訪，分娩新生兒隨訪至1歲，記錄妊娠結局、產后超聲復查情況、出生后手術治療效果以及生長發育情況。

1.4統計學處理 采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1基本信息 納入研究的216例CHD胎兒中，Ⅰ組91例，占42.13%；Ⅱ組66例，占30.56%；Ⅲ組59例，占27.31%。孕婦年齡19～41歲、中位年齡27歲，孕周18～30周、中位孕周為26周。夫妻雙方無明顯遺傳病家族史，孕婦不合并嚴重內外科疾病。

2.2染色體核型分析結果 216例CHD胎兒中，檢測出19例染色體異常，檢出率為8.80%，其中，Ⅰ組檢測出6例 (6.59%)，Ⅱ組檢測出6例 (9.09%)，Ⅲ組檢測出7例(11.86%)，3組異常檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。19例染色體異常包括：4例21-三體綜合征；4例18-三體綜合征；2例13-三體綜合征；1例45，X；1例47，XXY；4例染色體缺失，分別是46,XN,del(13)(p11.1)、46,XN，del(3)(q24q25)、46，XX，del(X)(q26.3-q28)、46,XN,del(10)(q26.3)；1例染色體重復，46，XN，dup(6)(q23.3-q25.3)；1例染色體平衡易位46，XN，t(3；7)(p34;q12)mat，1例5號染色體倒位，46,XN,inv(5)(p15.3q13)mat。其余197例染色體正常，其中包括6例染色體多態性；2例46，XN，inv(9)；1例46，X，inv(Y)；2例46，XN，1qh+；1例46，XN，16qh+，均對父母進行外周血染色體核型分析，判斷來源于正常表型的父母其中一方，歸入正常染色體。

2.3CMA檢測結果 216例CHD胎兒標本均進行CMA檢測，共檢測出31例致病性CNV，檢出率為14.35%，在19例染色體核型分析異常病例中，12例為染色體非整倍體，4例染色體缺失，1例染色體重復，CMA檢測出相同結果；1例染色體平衡易位及1例染色體5號倒位，CMA未檢測出異常。3組胎兒CMA檢測提示致病性CNV檢出率分別為：Ⅰ組檢測出8例(8.79%)，Ⅱ組檢測出9例(13.64%)，Ⅲ組檢測出14例(23.73%)，3組差異無統計學意義(P>0.05)，見表1、2；在197例染色體正常的CHD胎兒中，CMA額外檢測到14例異常，將CHD胎兒的遺傳學病因檢出率提高了7.11%。此外，CMA再檢測出13例VOUS，VOUS檢出率為6.02%(13/216)，進一步對父母外周血進行CMA檢測，提示其中9例來源于正常表型父母其中一方，最終判斷為家族性變異，歸為良性CNV，4例為新發變異，分別是：1例在5號染色體5q11.2位置發生重復，片段大小約2.0 Mb；1例在16號染色體16q23.3-q24.1位置發生缺失，片段大小約647 kb；1例在染色體11q13.2-q13.3位置發生缺失，片段大小1.6 Mb；1例在4號染色體4q27位置發生缺失，片段大小約547 Kb，這些CNV臨床意義目前無法明確。

2.4隨訪 對216例CHD胎兒的妊娠結局及產后生長發育情況進行隨訪，128例分娩(59.26%)，86例終止妊娠(39.81%)，失訪2例(0.93%)。CMA檢測提示31例致病性CNV，全部終止妊娠，其中包括12例染色體非整倍體。4例新發的VOUS中，1例胎兒為單純室間隔缺損，1例胎兒為右位主動脈弓，孕婦選擇保留胎兒，追蹤至出生后1歲，目前生長發育正常；另外1例為法洛四聯癥、1例左心發育不良，孕婦選擇終止妊娠。見表2。

表1 CHD胎兒染色體核型分析及CMA檢測情況比較[n(%)]

表2 CHD胎兒CMA檢測致病性CNV的相關情況及隨訪結果

3 討 論

本研究216例CHD胎兒中，檢測出19例染色體異常，檢出率為8.80%，同時進行CMA檢測，共檢測出31例致病性CNV，檢出率為14.35%，在197例染色體正常的CHD胎兒中，CMA額外檢測到14例異常，將CHD胎兒的遺傳學病因檢出率提高了7.11%，這與國內外相關報道基本相符。一項國內研究報道，在CHD胎兒中染色體異常的檢出率為10.2%(18/176)，對88例染色體核型分析結果正常的CHD胎兒進行CMA檢測，致病性CNV檢出率額外增加到16%(14/88)[7]，國外多項研究表明，在患有CHD的新生兒中，應用CMA技術可于10%左右的患兒中檢出致病性CNV[8-9]，另一項回顧性分析顯示，580例染色體核型分析結果正常的CHD患兒應用aCGH 技術檢測，顯示致病性CNV的檢出率為7.9%[10]。因此，CHD胎兒的遺傳學病因，除了與染色體數目及結構的異常相關，還包括染色體微缺失、微重復，而傳統的染色體核型分析只能檢出大于10 Mb的大片段缺失及重復，增加CMA檢測可以明顯提高CHD胎兒遺傳學病因的檢出率。

在216例CHD胎兒中，根據結構畸形情況分成3組：單一心臟結構畸形組、多發心臟結構畸形組、心內合并心外結構畸形組，這3組病例的染色體異常檢出率與CMA提示致病性CNV的檢出率比較，差異均無統計學意義(P>0.05)，與國內相關報道相符[11-12]。因此，無論是單一的心臟結構畸形，還是多發心臟結構畸形，無論是否合并心外畸形，均與染色體異常相關，針對所有心臟結構畸形的胎兒，均應告知孕婦及家屬胎兒染色體異常風險，并且建議行介入性產前診斷，為評估CHD胎兒的遠期預后提供科學依據。

本研究在216例CHD胎兒中，發現4例22q11.2微缺失綜合征，異常診斷率為1.85%，據國內一項研究報道，在204例心血管異常的產前標本中，檢出6例22q11.2微缺失綜合征，診斷率為2.94%[13]。該區域缺失可導致心臟畸形、異常面部形態、胸腺發育不全、腭裂和低血鈣等臨床表現，也稱為DiGeorge綜合征,發病率為1/4 000[14-15]。該遺傳綜合征患兒預后不良，無法根治，因此，CMA技術從出生后患兒的檢測走向胎兒的產前診斷，其臨床應用價值更高。

由于CMA技術能夠快速準確地確定胎兒染色體異常的位置及片段大小，分辨率高，檢測效率快，目前多項研究推薦將CMA技術作為產前超聲結構異常胎兒遺傳學病因的一線檢測方法[16-17]。但是，由于CNV在人類基因組中的分布非常廣泛，約占基因組序列的12%[18]，導致臨床在應用CMA技術的過程中，對CNV的判斷和臨床意義的解釋面臨許多困難。在產前診斷中使用CMA檢測，經常出現無法判讀和解釋的VOUS。一項對143例室間隔缺損胎兒標本的研究中，CMA檢測出17例VOUS(11.9%)，通過進一步對父母進行CMA檢測，顯示12例遺傳自正常表型父母，為良性CNV,但仍有5例(3.5%)為新發，無法判讀臨床意義[19]。本研究中，VOUS檢出率為6.02%(13/216)，進一步對父母外周血進行CMA檢測，提示其中9例來源于正常表型父母其中一方，最終判斷為家族性變異，歸為良性CNV，4例為新發變異。因此，即使對父母進行CMA檢測，仍然無法對所有VOUS的臨床性質做出確切的判斷，應根據胎兒的超聲表現，謹慎考慮胎兒去留，避免不必要的終止妊娠。

任何檢驗技術均有其自身的局限性，CMA無法檢出平衡性染色體重排，如平衡易位、倒位和大多數基因位內點突變[20]。本研究中，有1例染色體平衡易位及1例染色體5號倒位，CMA未檢測出異常。

綜上所述，CMA技術在CHD胎兒產前診斷中的應用，可增加遺傳學病因的檢出率，在臨床應用中，應結合超聲表現及染色體核型分析結果，做出全面的結果判讀和解釋。本研究的不足之處在于部分復雜性心臟畸形以及合并多系統畸形的病例拒絕進行產前診斷，而選擇直接終止妊娠，導致病例結構的偏倚，未來需進一步收集多中心病例，可以做出更客觀的數據分析。